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复制型HBV小鼠模型建立及可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠制备

作　者: 郭燕菊
导　师: 周育森
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 水动力法乙型肝炎病毒动物模型转基因小鼠尿激酶原激活剂
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的1、构建及鉴定水动力法转染HBV小鼠模型,探讨该模型在HBV疫苗评价中的应用。2、制备可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠,为人肝嵌合体小鼠模型的建立奠定基础。方法1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用(1) pAAV-HBV1.3质粒的鉴定:含腺相关病毒倒转末端重复序列元件与包含1.3个拷贝HBV基因组(ayw亚型)的HBV表达质粒pAAV-HBV1.3(由中国疾控中心病毒病所谭文杰教授惠赠),酶切鉴定并将该质粒转染Huh7肝癌细胞系,ELISA方法检测HBsAg、HBeAg的分泌表达水平。(2)水动力法HBV小鼠模型的构建:将pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射C57BL/6小鼠,分别于注射后10天、30天、60天采集血液和肝组织标本,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg表达;Real-Time PCR检测血清及肝组织病毒载量;HE染色、免疫组化染色检测肝组织病理学改变及病毒抗原在肝组织中的定位及表达。(3)水动力法HBV小鼠模型的优化:采用免疫抑制剂地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠,0.2ml/只/次(50mg/Kg)隔日一次连续3次,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基础上制备乙肝病毒转染小鼠模型,于注射后每周采集尾静脉血,进行血清HBsAg、HBeAg检测及病毒载量检测。(4)水动力法转染HBV小鼠模型的鉴定:利用HBV商品化疫苗(商品名:安在时,成分:HBsAg)免疫小鼠,2μg/只,14天1次,共2次,生理盐水为对照,200μl/只;第2次加强免疫14天后用水动力法转染pAAV-HBV1.3,进行免疫保护性实验,在不同时间点采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR检测血清病毒载量。(5)水动力法转染HBV小鼠模型在疫苗评价中的应用:用重组腺病毒(AdS)免疫C57BL/6小鼠,同时设置安在时疫苗(商品化疫苗)及生理盐水为对照。分别于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAb,最后1次免疫14天后尾静脉水动力法注射pAAV-HBV1.3质粒溶液1.6m(l20μg/只),于不同时间点采集尾静脉血,ELISA检测血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR检测血清病毒载量。2、可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备(1) pTet-on-Albumin转基因小鼠的制备:构建及鉴定含血清白蛋白增强子和启动子序列的pTet-on-Albumin载体,在细胞水平验证Albumin启动子转录活性,通过将pTet-on-Albumin载体显微注射B6/CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠,然后与野生型C57BL/6杂交,PCR筛选转基因阳性小鼠,RT-PCR、Western blot鉴定rtTA mRNA及蛋白表达。(2) pTRE2-uPA转基因小鼠的制备:构建及鉴定含小鼠uPA基因的pTRE2- uPA载体,与pTet-on质粒共转Huh7细胞系,细胞水平鉴定uPA的表达及其生物活性;通过将pTRE2-uPA载体显微注射B6/CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠,与野生型C57BL/6杂交,PCR筛选转基因阳性小鼠。(3)可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备:将已获得稳定的且在小鼠肝细胞特异性表达Albumin-rtTA的转基因小鼠与TRE2-uPA转基因小鼠杂交,子代鼠Dox诱导,诱导12周后处死小鼠,取血清和肝组织进行ALT和肝组织uPA表达及病理学检测,获得可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠。结果1、复制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用(1) pAAV-HBV1.3质粒的鉴定结果:将包含1.3倍全长HBV基因组的质粒pAAV-HBV1.3酶切分析与预期结果相符,pAAV-HBV1.3脂质体转染Huh7细胞72h后收集细胞培养上清,ELISA方法检测HBsAg、HBeAg均为阳性,OD值分别为0.309及1.279,对照(未转染的Huh7细胞培养上清)均为阴性。(2)水动力法HBV小鼠模型的鉴定结果:C57BL/6小鼠尾静脉水动力法注射pAAV-HBV1.3,10天时通过ELISA方法检测小鼠血清HBsAg、HBeAg,结果均为阳性,感染率为100%;30天、60天时血清HBsAg、HBeAg ELISA检测结果均为阴性。Real-Time PCR检测小鼠血清及肝组织病毒载量,结果显示,注射质粒10天、30天及60天时实验组小鼠血清及肝组织病毒载量明显高于对照组,且在10天时达高峰,以后随时间延长,血清及肝组织中病毒载量降低。免疫组化染色可见,10天时注射pAAV-HBV1.3小鼠肝组织均存在HBsAg、HBcAg阳性细胞,注射HBV质粒30天和60天时小鼠肝组织未检测到HBsAg、HBcAg阳性细胞。(3)水动力法HBV小鼠模型的优化结果:免疫系统功能抑制小鼠在转染pAAV-HBV1.3质粒后各组间HBsAg、HBeAg总体表达持续时间有显著差异(P<0.01,P<0.05),且均为IP DEX 8周组表达最长,HBsAg和HBeAg在pAAV-HBV1.3转染后第8周转为阴性。结果显示,通过抑制小鼠免疫状态,可明显延长病毒在小鼠体内复制和表达时间。(4) HBV商品化疫苗对水动力法转染HBV小鼠模型鉴定结果:安在时疫苗免疫小鼠2次后即产生保护性抗体,pAAV-HBV1.3转染后血清HBsAg、HBeAg均为阴性,生理盐水组小鼠转染pAAV-HBV1.3后血清HBsAg、HBeAg均为阳性。生理盐水组小鼠转染pAAV-HBV1.3后病毒载量明显高于其他各组。实验结果表明,高压水动力法转染HBV小鼠模型可有效应用于乙肝疫苗免疫效果的评价。(5)水动力法转染HBV小鼠模型用于新型疫苗评价的实验研究:第2次加强免疫后安在时疫苗组HBsAb均为阳性,AdS组及生理盐水组均为阴性,安在时组与其它两组间差异显著(P<0.01,P<0.01),第4次加强免疫后AdS组HBsAb全部转为阳性,生理盐水组HBsAb为阴性,两组间差异显著(P<0.01);pAAV- HBV1.3质粒转染后安在时疫苗组HBsAg、HBeAg均为阴性,AdS组HBsAg、HBeAg持续时间明显短于生理盐水组,两组在10天、12天时HBsAg阳性率有显著差异(P<0.01,P<0.05),在15天时HBeAg阳性率有显著差异(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示AdS组与生理盐水组病毒载量明显高于安在时疫苗组(P<0.05 ,P<0.05),AdS组与生理盐水组转染后20天病毒载量差异显著(P<0.05)。实验结果表明,构建的表达HBV preS1-S-preS2的重组腺病毒候选疫苗可诱导产生一定的免疫保护作用,但免疫效果明显不如商品化疫苗。该实验同时也表明,水动力法转染HBV小鼠模型在乙肝疫苗的免疫效果评价中有重要的应用价值。2、可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备(1) pTet-on-Albumin转基因小鼠的制备:构建四环素诱导表达系统肝组织特异性表达rt的调控质粒pTet-on- Albumin,经BamH I酶切可见4条带(3026bp、2681bp、2000bp、1257bp),与pTRE2-EGFP共转染Huh7细胞,Dox诱导24h,结果表明未诱导组没有绿色荧光表达,而诱导组可见绿色荧光,细胞水平验证Albumin启动子具有转录活性。pTet-on- Albumin转基因小鼠出生2周后提取基因组DNA,PCR阳性为转基因首建鼠,与野生型C57BL/6小鼠交配,2周龄仔鼠剪尾提取基因组DNA,PCR检测阳性为F1代小鼠,繁育获得子代鼠,诱导后获得子代鼠仅在肝组织检测到rtTA mRNA及rtTA蛋白表达。(2) pTRE2-uPA转基因小鼠的制备:pTRE2-uPA质粒经SmaⅠ、HindⅢ双酶切得4条带(3549bp、1027bp、960bp和158bp),与pTet-on共转染Huh7细胞,Dox诱导36h后提取转染细胞总RNA,RT-PCR检测uPA的表达,诱导组细胞扩增出1.3 kb的目地条带;溶圈法检测细胞培养上清中的uPA生物活性,除Dox诱导组细胞培养上清可观察到溶圈现象,其他实验组均未检测到明显的溶圈现象。pTRE2-uPA转基因小鼠分别在出生2周后提取基因组DNA,PCR阳性为转基因首建鼠,与野生型C57BL/6小鼠交配,2周龄仔鼠剪尾提取基因组DNA,PCR检测阳性为F1代小鼠。(3)可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠的制备:pTet-on-Albumin F1代小鼠与pTRE2-uPA F1代小鼠交配,PCR鉴定阳性为可诱导肝细胞特异性表达uPA双转基因小鼠,病理切片HE染色可见Dox诱导后肝组织点状坏死灶,免疫组化结果可见肝细胞中散在的uPA表达。血清ALT结果为双转基因小鼠Dox诱导后ALT显著高于未诱导组(P<0.01)。结果显示,成功制备可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠,并经过5代繁育,获得pTet-on-Albumin-uPA双转基因纯合子小鼠,目的基因表达稳定。结论1、通过高压水动力法建立了HBV转染小鼠模型;通过抑制小鼠免疫状态,可延长病毒在肝组织内的复制与表达。2、利用商品化疫苗进行HBV小鼠模型的鉴定,实验表明该模型可以有效应用于疫苗评价;利用该模型对一种新型候选基因疫苗进行了评价。3、成功制备了可诱导肝细胞特异性表达uPA转基因小鼠模型,并获得稳定传代的纯合子小鼠,为HBV感染人肝嵌合体小鼠模型的建立奠定了基础。

全文目录

中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-19
第一部分复制型HBV 小鼠模型的建立及其在疫苗评价中的应用  19-46
  1-1 水动力法转染HBV 小鼠模型的建立  19-35
    材料与方法  19-26
    结果  26-32
    讨论  32-35
  1-2 水动力法HBV 转染小鼠模型的鉴定及其在疫苗评价中的应用  35-46
    材料与方法  35-38
    结果  38-43
    讨论  43-46
第二部分可诱导肝细胞特异性表达uPA 转基因小鼠的制备材料与方法  46-64
  材料与方法  46-54
  结果  54-60
  讨论  60-64
结论  64-65
参考文献  65-70
综述乙型肝炎病毒动物模型的研究进展  70-79
主要仪器设备  79-80
主要试剂  80-81
个人简历  81-82
致谢  82

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