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肠球菌中β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

作　者: 张浩忠
导　师: 刘同军
学　校: 山东轻工业学院
专　业: 生物化工
关键词: β-D-葡萄糖苷酶 肠球菌 银杏提取物 条件优化 分离纯化 酶学性质
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


银杏提取物(EGb761)含有24 %银杏黄酮内酯(Ginkgo-flavone glycosides)及6 %萜类化合物(Terpenoids),它可望成为治疗阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)的有效药,但是其临床前期试验,包括代谢等还没有能够按照药物研发的现代标准来进行。银杏提取物的代谢主要是通过肠道微生物菌群分泌的水解酶来进行的,由此,本文选定肠球菌为模式菌株,通过系列研究不但能够初步阐明机体代谢吸收银杏提取物中主要有效成分的酶学及分子生物学的机制,而且为按照现代药物标准研发银杏系列产品做好方法上的准备并提供理论依据,因此具有理论研究和实际应用双重重要意义。目前,国内外尚未见此方面成功的研究报道。首先通过响应面法优化设计得到了肠球菌最佳培养基配方为:葡萄糖1.87896 %、酵母膏0.77474 %、牛肉膏0.3 %、蛋白胨1 %、KNO36.25 mmol/L、NaCl0.5 %,最适培养条件为:装液量60 mL、初始pH7.0、接种量3 %、温度36℃,接种后置于170 r/min恒温摇床中培养20 h后,于OD560处测定吸光度值为0.748,比优化前的0.682提高了9.7 %。其次确定了肠球菌中β-D-葡萄糖苷酶的酶活测定方法:在10mL具塞比色管中加入1.5 mL pH5.0的0.02 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,再用适当刻度的移液枪吸取0.1 mL粗酶提取液加入其中,于45℃恒温水浴中预热一定时间,再加入已预热5～10 min的0.4 mL1 mmol/L底物pNPG溶液,用秒表精确计时,14 min后取出立即加入2 mL1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应,在比色管架上冷却至室温,于400nm处测光吸收值。再次通过单因素和正交实验对肠球菌产β-D-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了优化,得到基础产酶培养基的最佳配比为:玉米粉3 %,酵母浸粉1.2 %,蛋白胨1 %,葡萄糖2 %,K2HPO4 0.1 %,MgSO47.5 mmol/L;相应的最佳肠球菌产酶发酵条件为:初始pH7.0,发酵温度37℃,发酵时间168 h,摇床转速180 r/min,装液量50 mL(250 mL三角瓶),接种量为3%,此时肠球菌产β-D-葡萄糖苷酶的酶活最高,达到19.1242 U/(mL·min)。肠球菌产β-D-葡萄糖苷酶发酵液经过40 %～80 %硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤分离纯化得到了β-D-葡萄糖苷酶纯品,该酶的比活力由3.37 U/mg提高到33 U/mg,纯化倍数为9.79倍,且酶的回收率为5.33 %。提纯酶蛋白经NATURE-PAGE和SDS-PAGE电泳,确定来源于肠球菌的β-D-葡萄糖苷酶相对分子量约为121KD,由两个亚基组成(65KD和54KD)。提纯后的β-D-葡萄糖苷酶经酶学性质研究发现酶耐酸性较强,具有较强的热稳定性。5 mmol/L的Mg2+、Ba2+、Ca2+对β-葡萄糖苷酶有激活作用;而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+对酶有显著的抑制作用。此外,pNPG对该酶有很强底物特异性,动力学研究表明肠球菌β-D-葡萄糖苷酶的米氏常数Km为0.05 mmol/L,Vmax为18.0375 U/L。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第1章 绪论  12-25
  1.1 银杏提取物  12-15
    1.1.1 银杏提取物有效成分  12-13
    1.1.2 银杏提取物的临床应用  13-15
    1.1.3 银杏提取物的毒副作用  15
    1.1.4 银杏提取物有效成分分析方法  15
    1.1.5 银杏提取物展望  15
  1.2 肠球菌  15-19
    1.2.1 肠球菌的分类  15-16
    1.2.2 肠球菌的生物学性质  16-17
    1.2.3 肠球菌的致病机理  17
    1.2.4 常见的肠球菌感染与疾病  17-18
    1.2.5 肠球菌的治疗  18
    1.2.6 益生肠球菌的展望  18-19
  1.3 β-D-葡萄糖苷酶  19-24
    1.3.1 β-D-葡萄糖苷酶的来源  19
    1.3.2 β-D-葡萄糖苷酶的理化性质  19-20
    1.3.3 β-D-葡萄糖苷酶的催化机制  20-21
    1.3.4 β-D-葡萄糖苷酶的提取、分离纯化及酶活测定方法  21-22
    1.3.5 β-D-葡萄糖苷酶的应用  22-24
    1.3.6 β-D-葡萄糖苷酶展望  24
  1.4 研究内容与意义  24-25
第2章 肠球菌培养条件优化研究  25-39
  2.1 材料与方法  25-28
    2.1.1 实验材料  25-27
    2.1.2 方法  27-28
  2.2 结果与讨论  28-38
    2.2.1 测定肠球菌的生长曲线  28-29
    2.2.2 单因素实验  29-33
    2.2.3 Plackett-Burman 实验设计  33-34
    2.2.4 最陡爬坡实验  34
    2.2.5 响应面（RSM）实验设计  34-38
  2.3 小结  38-39
第3章 肠球菌β-D-葡萄糖苷酶活力测定条件的研究  39-47
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 材料与试剂  39-40
    3.1.2 方法  40-41
  3.2 结果与分析  41-46
    3.2.1 对硝基苯酚-光密度标准曲线  41-42
    3.2.2 肠球菌中β-D-葡萄糖苷酶活性分析条件的研究  42-45
    3.2.3 验证最优酶活测定条件  45-46
  3.3 小结  46-47
第4章 肠球菌产β-D-葡萄糖苷酶条件优化  47-58
  4.1 材料与方法  47-49
    4.1.1 实验材料  47-48
    4.1.2 方法  48-49
  4.2 结果与讨论  49-57
    4.2.1 基础产酶培养基的筛选  49-50
    4.2.2 基础产酶培养基组分优化  50-53
    4.2.3 发酵条件优化实验  53-57
  4.3 小结  57-58
第5章 β-D-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质探究  58-72
  5.1 材料与方法  58-64
    5.1.1 实验材料  58-60
    5.1.2 方法  60-64
  5.2 结果与讨论  64-70
    5.2.1 β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化  64-66
    5.2.2 β-D-葡萄糖苷酶的基本性质  66-70
  5.3 小结  70-72
第6章 结论与展望  72-75
  6.1 结论  72-73
  6.2 展望  73-75
参考文献  75-84
致谢  84-85
在学期间主要科研成果  85

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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