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犬细小病毒LM株的序列分析及VP2基因的真核表达

作　者: 石薇琳
导　师: 刘明
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 犬细小病毒序列分析 VP2表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)属于细小病毒科,细小病毒属。可引起犬出血性腹泻和心肌炎,使白细胞大量减少,在幼犬中的发病率和死亡率都很高。是危害养犬业最为严重的传染病之一。本研究对CPV-LM株病毒进行传代培养,对形态学、物理化学和生物学等进行鉴定及分析。在F81细胞上培养病毒,病毒可大量增殖,使细胞发生肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变;电镜观察病毒粒子呈立体对称,直径为20 nm,无囊膜;能凝集猪红细胞,第4代病毒的血凝效价为210,血凝能被抗犬细小病毒单克隆抗体所抑制;免疫酶染色试验说明病毒感染了F81细胞并能与已知犬细小病毒单抗反应。采用PCR方法对CPV-LM株分5段进行扩增,测序拼接后得到包括3’端回文结构及所有阅读框架的长约4 974 bp基因组。对犬细小病毒基因进行核苷酸序列分析,根据CPV的分型依据推断CPV-LM株为CPV-2型。对非结构蛋白NS基因分析发现核苷酸突变位点较多,但多为同义密码子突变,与参考株比较同源率可达99%以上。对结构蛋白VP2基因分析发现其所编码氨基酸发生突变347A→T、562V→L、564S→N和568G→A;CPV-LM与Vac1株、CPV-Cv株、388/05-3株和CPVint株属同一分支,与所选的CPV-2型毒株比较其核苷酸序列的同源率在99%以上,与其他抗原型毒株的同源率也都在97.9%以上。将VP2基因插入真核表达载体pEGFP-C1,构建重组表达质粒pEGFP-VP2。重组质粒与空载体质粒同时转染293T细胞,72 h后在荧光显微镜下可见重组质粒转染的细胞中出现颗粒状绿色荧光,说明pEGFP-VP2发生了瞬时表达,证明VP2基因具有正确的阅读框。设计两对引物扩增VP2基因,得到VP2(BamHⅠ/EcoRⅠ)和VP2(BamHⅠ/XhoⅠ),将两段VP2基因分别插入杆状病毒表达载体pFastBac 1和pFastBac HT。构建了4种重组转移载体质粒,分别命名为pFastBac 1-VP2(BamHⅠ/EcoRⅠ)、pFastBac 1-VP2(BamHⅠ/XhoⅠ)、pFastBac-HT-VP2(BamHⅠ/EcoRⅠ)和pFastBac-HT-VP2(BamHⅠ/EcoRⅠ)。将其分别转座入DH10Bac感受态细胞,提取Bacmid DNA,获得4种相应的重组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9,获的重组杆状病毒,命名为:rBV-VP2(B/E)、rBV-VP2(B/X)、rBV HT-VP2(B/E)和rBVHT-VP2(B/X)。通过免疫酶染色、SDS-PAGE和Western-blot实验,结果表明4种重组Bacmid在杆状病毒表达系统中均得到了表达,并具有反应活性。本研究对CPV-LM株进行生物学鉴定,用PCR方法克隆得到了包括3’端回文结构及涵盖所有阅读框架的长为4 974 bp的基因组序列,丰富了CPV基因库信息,为CPV的感染性克隆奠定基础;对主要衣壳蛋白VP2基因进行序列分析,为探索CPV抗原漂变奠定了基础;借助于杆状病毒表达系统制备VP2的蛋白,为进一步研制VP2蛋白特异单抗及筛选CPV基因工程苗创造了条件。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-20
  1.1 犬细小病毒的概述  11-16
    1.1.1 形态和理化特性  11
    1.1.2 抵抗力  11
    1.1.3 血凝性  11
    1.1.4 培养特性  11-12
    1.1.5 病毒的基因组特征  12
    1.1.6 病毒编码的蛋白  12
    1.1.7 VP2 结构蛋白  12-13
    1.1.8 CPV 的致病机理  13-14
    1.1.9 CPV 的变异  14-15
    1.1.10 犬细小病毒感染的症状及病理变化  15
    1.1.11 CPV 的诊断技术  15-16
    1.1.12 CPV 的防治研究  16
  1.2 昆虫杆状病毒表达系统  16-19
    1.2.1 杆状病毒概述  16-17
    1.2.2 杆状病毒表达系统概述  17
    1.2.3 杆状病毒表达系统表达外源基因特点  17-18
    1.2.4 Bac-to-Bac 表达系统  18-19
  1.3 实验目的及意义  19-20
2 材料与方法  20-33
  2.1 材料  20
    2.1.1 病毒  20
    2.1.2 主要试剂  20
  2.2 实验方法  20-33
    2.2.1 病毒的培养及鉴定  20-22
    2.2.2 病毒基因的克隆  22-25
    2.2.3 VP2 基因的瞬时表达  25-26
    2.2.4 VP2 基因在杆状病毒系统中的表达  26-33
3 结果  33-48
  3.1 病毒的鉴定  33-34
    3.1.1 病毒的免疫电镜观察  33
    3.1.2 病毒的血凝鉴定  33
    3.1.3 病毒的免疫酶染色法鉴定  33-34
    3.1.4 病毒滴度的测定  34
  3.2 病毒的基因克隆  34-41
    3.2.1 PCR 扩增  34-35
    3.2.2 重组质粒的鉴定  35-36
    3.2.3 CPV-LM 株主要蛋白基因序列分析  36-41
  3.3 VP2 基因真核表达质粒的构建  41-42
    3.3.1 VP2 基因真核表达质粒的构建  41-42
    3.3.2 VP2 基因真核细胞的瞬时表达  42
  3.4 VP2 基因在杆状病毒系统中的表达  42-48
    3.4.1 VP2 基因的制备  43
    3.4.2 构建重组转移载体质粒的鉴定  43-44
    3.4.3 获得重组杆粒的鉴定  44
    3.4.4 杆状病毒的 PCR 鉴定  44
    3.4.5 杆状病毒表达 VP2 基因的免疫电镜观察  44-45
    3.4.6 杆状病毒表达 VP2 蛋白的血凝性测定  45
    3.4.7 免疫酶染色法检测 VP2 蛋白的表达  45-46
    3.4.8 SDS-PAGE 试验检测 VP2 蛋白的表达  46-47
    3.4.9 Western blot 检测 VP2 蛋白的表达  47-48
4 讨论  48-52
  4.1 病毒的培养及鉴定  48
  4.2 CPV-LM 株序列分析  48-50
    4.2.1 犬细小病毒 NS 基因的分析  49
    4.2.2 犬细小病毒 VP2 基因的序列分析  49-50
  4.3 VP2 基因的真核表达  50-52
5 结论  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-59
附录  59-62
攻读硕士期间发表的论文  62

犬细小病毒LM株的序列分析及VP2基因的真核表达

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