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不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选

作　者: 王玉
导　师: 杨忠华；吕早生
学　校: 武汉科技大学
专　业: 生物化工
关键词: 不对称还原羰基还原酶苯乙酮羰基还原酶分离纯化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 66次
引　用: 2次
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内容摘要

手性醇是不对称中心碳原子上连有羟基的一类化合物,单一对映体的手性醇是合成多种手性药物的重要中间体。利用活性微生物细胞或分离纯化的氧化还原酶催化相应前手性羰基化合物不对称还原,是合成手性醇的重要方法之一。本文以苯乙酮为唯一碳源,成功从土壤中筛选出一株高效催化苯乙酮不对称还原菌株,可将苯乙酮还原为R-1-苯基乙醇。进一步研究了该菌株催化苯乙酮不对称还原的特性。对筛选出的高效菌株进行鉴定,确定其归于伯杰氏系统细菌学手册第八版微杆菌属(Microbacterium sp.)。从该Microbacterium sp.细胞内分离纯化出具有催化不对称还原能力的羰基还原酶,并考察其酶学性质。具体内容如下:1)利用苯乙酮为唯一碳源,对土壤样品中的微生物进行分离,共分离纯化到180株菌株。以苯乙酮为模型底物,对分离纯化出的菌株进行筛选,得到18株对苯乙酮具有还原活性的菌株。其中14株菌株以R-1-苯基乙醇为主,另4株以S型为主。菌株#1-2能高效不对称还原苯乙酮为R-1-苯基乙醇,产率达到72.1%。进一步研究了菌株#1-2催化苯乙酮不对称还原的反应特性,对各种反应条件如温度、反应体系pH、底物浓度、辅助底物、反应时间等因素进行了考察,优化了反应条件。得到该菌株不对称还原苯乙酮的最优还原条件为:初始苯乙酮浓度15 mmol/L,温度30℃,30 g/L的异丙醇为辅助底物,pH=6.0,反应30 h。2)为全面认识菌株#1-2,运用形态学、生理生化以及分子生物学方法对菌株#1-2进行了鉴定。其主要特性为:菌落圆形,有同心环状,边缘整齐向四周呈放射状扩散,质地紧密;菌丝不丰茂,较疏松并且平铺于表面;基丝有隔,易断裂,气生菌丝较直,无螺旋状结构,呈分枝状;孢子丝呈链状直丝,菌丝断裂形成孢子,孢子圆柱形。PCR扩增该菌16S rDNA序列全长为1459 bp。利用BLAST软件将测得的基因序列与Genbank数据库进行序列比对分析,并进行同源性比较和进化树绘制。菌株#1-2与微杆菌属的14株菌株同源性为97%~99%。在以菌株#1-2的16S rDNA序列为基础构建的系统发育树中,菌株#1-2与微杆菌属的几株细菌处于大的分支内。根据菌株#1-2的形态、生理生化特性以及16S rDNA的序列比对结果,鉴定该菌株属于伯杰氏系统细菌学手册第八版微杆菌属(Microbacterium sp.)。但该菌与伯杰氏系统细菌学手册第八版上所记载的微杆菌属的4个种在形态和生理生化特性上有一定差异,说明菌株#1-2可能是微杆菌属的一株新菌。3)为进一步对该菌催化不对称还原反应的酶系有深入认识,我们对酶的分离及酶学特性进行了初步研究。将细胞进行超声波破碎,制备粗酶液,经过DEAE离子交换层析和Phenyl Sepharose疏水层析,对新筛选出的Microbacterium sp.中羰基还原酶进行了初步纯化,纯化倍数为50倍,将比活由粗酶的0.072 U/mg提高到3.58 U/mg,酶活回收率为13.5%。测定了初步纯化羰基还原酶的酶学性质,表明该酶为依赖于NADH的羰基还原酶。酶的最适反应温度为40℃,催化还原反应的最适pH为7.0。该羰基还原酶的热稳定性较好,即使在60℃酶活力未见明显下降,仍可保持70%以上的相对酶活;酶蛋白对环境pH的变化比较敏感,仅在pH值6.0至8.0之间较为稳定。Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用,EDTA的加入对酶活影响不明显。

不对称还原前手性芳香酮微生物的筛选

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