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DHPLC技术应用于两种常见出生缺陷的突变分析

作　者: 李倩
导　师: 徐湘民；熊符
学　校: 南方医科大学
专　业: 医学遗传学
关键词: 变性高效液相色谱非缺失型α-地中海贫血 α-异常血红蛋白病基因分型基因突变单纯性先天性心脏病 GATA4基因 NKX2.5基因 TFAP2B基因
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

所谓出生缺陷是指凡出生时就有的形态结构、生理功能的异常或代谢缺陷所致的异常。随着现代医学模式的改变,人类疾病谱和死亡谱发生了很大的变化,出生缺陷已逐渐成为我国围生期婴儿死亡的主要原因。根据卫生部发布的出生缺陷监测结果,全国出生缺陷总发生率约为11‰,约8000万残疾人口中有70%是由出生缺陷所致。2004年田佩玲等对广东省0-5岁儿童出生缺陷情况调查结果显示,广东地区最常见的出生缺陷为先天性心脏病,其次为地中海贫血。国内大量研究表明,先天性心脏病几乎占据了主要出生缺陷疾病的1／3,是最常见的心脏病。该病是与环境因素相关的多基因遗传病,其遗传背景复杂,致病机制尚不明确。地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一,地理分布广泛,人群携带率高,是严重危害人类健康的溶血性疾病。先天性心脏病和地中海贫血位列我国南方地区主要出生缺陷的前五位,已成为影响儿童身心健康及人口生存质量的重大公共卫生问题,给社会和家庭造成严重的经济和精神等方面的负担。因此,建立行之有效的疾病筛查和诊断技术可及早预防先天性心脏病和重症地中海贫血的发生,以期降低此类疾病的发病率,对提高我国人口素质具有重要意义。变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)技术已被证明是一种具有精确、高效、经济、高通量、半自动化等优点的用于检测已知突变及筛查未知突变的方法。其敏感性和特异性可达96%～100%,明显高于常用的变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)、错配化学切割分析(Chemical Cleavage of Mismatch, CCM)、构象敏感性凝胶电泳(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis,单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymorphisms, SSCP)等变异检测技术,目前已广泛应用于遗传性疾病的突变筛查和分子诊断中。基于DHPLC上述特点,本研究一方面试图建立一种快速、准确、经济且适于中国人群常见非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病的基因分型技术；另一方面,拟进行中国南方地区单纯性先天性心脏病易感基因突变的研究。第一章：基于PCR/DHPLC技术的中国人群非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病已知突变快速基因分型目的：非缺失型α-地中海贫血,α-异常血红蛋白病以及具备非缺失型α-地中海贫血特征的异常血红蛋白病是一组由α-珠蛋白基因点突变引起的遗传性溶血性血红蛋白病,目前已发现至少300种突变与该病有关。本研究拟建立一种快速、准确、经济的适于中国人群非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病已知致病突变的基因分型技术,使之可以应用于相关疾病的研究、临床诊断及大规模分子流行病学的人群筛查工作中。设计和方法：所有样品均来自我国南方地贫高发区,采用标准的饱和酚／氯仿法从外周血中提取基因组DNA。首先,收集本教研室已测通α-珠蛋白基因全长的107例测序样品作为群体研究资料分析α-珠蛋白基因上多态位点信息。其次,将33例包含10种致病突变和3种SNPs(来自群体资料)的样品作为标准品,根据变异位点分布特征分别设计两对扩增大片段(885bp和765bp)引物和两对扩增小片段(295bp和277bp)引物,进行常规聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR),将标准品的PCR产物用于建立DHPLC检测条件和与各种基因型对应的标准DHPLC图谱。另选取已测序和／或由反向点杂交技术确诊(Reverse Dot-Blot, RDB)的171例包含各种基因型的样品作为盲法对照的实验对象,用于评价本方法的准确性。结果与讨论：本研究通过33例标准品成功建立了非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病已知致病突变的PCR/DHPLC检测体系和与由10种突变及3种SNPs组成的22种基因型对应的标准DHPLC图谱。盲法实验中,171例由DHPLC方法检测得出的结果与之前检测结果完全一致。本研究建立的基于PCR/DHPLC技术的非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病已知突变基因诊断方法是一种高通量、高灵敏度、自动化、快速、准确、经济的点突变检测技术。该方法用于诊断中国人群常见非缺失型a-地贫,消除了目前广泛应用的RDB检测方法中存在的假阳性及假阴性问题,并能用于非缺失型α-地贫未知突变的检出。因此,该方法可适用于中国人群常见非缺失型α-地中海贫血和α-异常血红蛋白病的产前诊断和大规模的分子流行病学调查研究。第二章：基于PCR/DHPLC技术的中国南方单纯性先天性心脏病易感基因突变热点研究目的：先天性心脏病(Congenital Heart Disease, CHD)是胎儿时期心血管发育异常而导致的先天畸形,在新生儿非感染性死亡中占首位。仅表现为心脏畸形而不伴有其他系统的先天异常,称之为单纯性先天性心脏病(non-syndromic CHD)。CHD是与环境相关的,某显性主基因参与的多基因遗传性疾病,其遗传因素在疾病发生过程中存在明显的地区差异和种族差异。融合遗传学、发育学和生物化学等方法的研究发现,心脏发育相关的转录因子在CHD的分子基础中占据核心地位,转录因子基因突变成为目前先天性心脏病发病机制研究的焦点。最早发现的心脏特异性同源盒转录因子NKX2.5基因在国外人群共发现29种突变,突变率约4%。国内, Li T等在一个房间隔缺损家系中发现NKX2.5基因3个错义突变,而散发型先心病中至今仅孙淼发现了一个三碱基缺失突变。国外人群研究GATA4基因突变率仅为约2%,而中国汉族人群唐朝晖在31例患者中发现了两个新的错义突变,Weimin Zhang等在486例散发患者的12例不相关个体中发现9种新突变,包括一个小缺失突变、两个小插入突变和六个错义突变,提示中国汉族人群先天性心脏病患者转录因子基因突变检测率及突变位点可能与国外人群不同。神经嵴相关转录因子基因TFAP2B与动脉导管未闭发病呈强关联,国外研究在Char氏综合征家系及单纯动脉导管未闭家系中发现8种不同致病突变,而在中国人群未见报道。本课题拟研究GATA4、NKX2.5、TFAP2B基因在中国南方地区单纯性先心病患者中的突变位点及分布情况,并进一步分析基因型与表型间的关系。方法：收集224例单纯性先天性心脏病患者和121例健康个体的外周静脉血采用标准饱和酚／氯仿方法抽提基因组DNA,利用PCR反应以扩增GATA4、NKX2.5和TFAP2B基因的编码序列为主,经DHPLC技术直接对PCR产物进行检测,出现异常峰型的样本再经DNA测序验证变异性质。结果：1. GATA4基因中,在1例室间隔缺损病人发现一种新的错义突变,编码链第778位碱基C转换为碱基G(c.788 C>G),导致263位密码子由GCC转换为GGC,编码的氨基酸由丙氨酸转换为甘氨酸(p.Ala263G1y),位于GATA4蛋白高度保守的氨基端锌指结构域内；发现3种未经报道的同义突变,分别为c.531C>A (GCC>GCA, p.Ala177Ala), c.1308C>T (CAC>CAT, p.His435His)和c.1326G>A (GCG>GCA, p.Ala422Ala)。这些突变在对照组中均未检测到。2.NKX2.5基因中未检测到致病突变,仅发现三种已报道的SNPs:rs2277963 (c.63A>G, GAA>GAG, p.Glu21Glu), rs3729753 (c.606G>C, CTG>CTC p.Leu202Leu)和rs703752 (c.975-61 G>T),基因型频率及等位基因频率与NCBI数据库中已报道的中国人群携带率无显著性差异。3.首次在中国散发单纯性先天性心脏病患者中发现2种新的TFAP2B基因突变。1例完全性心内膜垫缺损患者携带c.31A>G (ATC>GTC,p.Ile11Val)错义突变,正常人群中未检测到该突变。病例组中另有6例表型不一的无关个体携带有同一种错义突变c.1006 G>A (GTC>ATC, p.Val336Ile),在正常人群中也被检测到,携带率为3／121。结论：1.GATA4基因错义突变c.788 C>G可能是中国南方人群室间隔缺损的发病原因之一。突变p.Ala263G1y使转录因子GATA4氨基端保守的锌指结构域发生改变,干扰室间隔正常的发生与发育从而导致缺损的发生。GATA4基因可能在心脏间隔的正常发育中起着重要作用。2.中国南方单纯性CHD患者中NKX2.5基因突变发生率极低,突变的发现可能限于某些家系或一些带有特殊表型的个体中。NKX2.5基因对我国南方地区先心病的致病作用有待进一步研究。3. TFAP2B基因突变不仅是家系中Char氏综合征遗传学方面的主要致病机制,与散发CHD的发病亦有关系。p.IlellVal突变可能是完全性心内膜垫的发病原因。c.1006 G>A突变对应多种心脏畸形,表明TFAP2B基因突变在南方单纯性先心病人群中对应的表型呈现多样化。新发现的两种错义突变扩展了TFAP2B基因的突变谱和表型谱。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-18
第一章:基于PCR/DHPLC技术的中国人群常见非缺失型α-地中海贫血以及α-异常血红蛋白快速基因分型  18-46
  第1节研究背景  18-22
  第2节材料与方法  22-32
    2.1 样品  22
    2.2 试剂  22-26
    2.3 仪器  26
    2.4 软件、数据库  26-27
    2.5 实验方法  27-32
  第3节实验结果  32-38
    3.1 引物纯度分析结果  32
    3.2 PCR产物特异性分析  32
    3.3 DHPLC分析结果  32-38
  第4节分析与讨论  38-42
  第5节参考文献  42-46
第二章:基于PCR/DHPLC技术的中国南方单纯性先天性心脏病易感基因突变的研究  46-84
  第1节研究背景  46-52
  第2节材料与方法  52-62
    2.1 研究对象  52-53
    2.2 试剂  53-54
    2.3 仪器  54-55
    2.4 软件、数据库  55
    2.5 实验方法  55-62
  第3节实验结果  62-73
    3.1 GATA4基因检测结果  62-66
    3.2 NKX2.5基因检测结果  66-69
    3.3 TFAP2B基因检测结果  69-73
  第4节分析与讨论  73-79
    4.1 GATA4基因  73-75
    4.2 NKX2.5基因  75-76
    4.3 TFAP2B基因  76-78
    4.4 总结  78-79
  第5节参考文献  79-84
攻读硕士期间所发表论文  84-85
附录一单纯性先天性心脏病标本采集登记表  85-86
附录二毕业论文统计合格证明  86-87
致谢  87-89
英文缩略词表  89-91

DHPLC技术应用于两种常见出生缺陷的突变分析

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