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葡萄糖和胰岛素对鹅肝细胞内葡萄糖代谢影响的研究

作　者: 向梳瑕
导　师: 王继文
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 鹅原代肝细胞葡萄糖胰岛素葡萄糖代谢脂肪酸代谢
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

动物肝脏是维持糖代谢平衡的主要器官,葡萄糖代谢和脂肪酸代谢相关基因的表达在激素和营养的作用下发生改变可以调控肝脏的脂肪沉积。本实验扩增出鹅葡萄糖代谢和脂肪酸代谢的关键基因PEPCK、ME、PPARβ的序列,然后以30日龄左右四川白鹅原代肝细胞为材料,添加不同葡萄糖和胰岛素处理鹅肝细胞,检测肝细胞活性、细胞VLDL分泌、细胞内外TG和ME活性的变化情况,并应用实时荧光定量PCR检测DGAT1、DGAT2、FoxO1、MTP、ApoB、PEPCK和CPT-1mRNA表达的变化情况,获得以下主要结果：(1)首次扩增得到了四川白鹅PEPCK、ME和PPARβ三个基因的部分CDS,它们的大小分别为636bp、297bp和766bp。(2)通过序列BLAST比对发现,鹅PEPCK、ME和PPARβ基因与原鸡或斑胸草雀的同源性都在90%以上,通过构建进化树发现鹅这几个基因都与原鸡或斑胸草雀聚为一类。(3)胰岛素能增加鹅原肝细胞生长活性,150nmol/L胰岛素是鹅肝细胞生长最适浓度,胰岛素浓度过高(200nmol/L)会引起肝细胞产生胰岛素抵抗,抑制细胞活性。合理浓度的葡萄糖也能够促进鹅肝细胞生长,胰岛素和葡萄糖的协同效应作用时效果更加明显。(4)胰岛素和葡萄糖均能增加鹅肝细胞的TG含量,协同作用时,效果更加明显。50nmol/L的胰岛素少量促进鹅肝细胞TG分泌,浓度增加胰岛素对TG的分泌量的影响不显著；葡萄糖促进鹅肝细胞TG分泌。50nmol/L浓度胰岛素促进鹅肝细胞VLDL分泌,浓度增加,分泌受到抑制；葡萄糖可以促进VLDL的分泌。(5)ME的活性随着葡萄糖浓度升高而增加；50nmol/L的胰岛素显著增加ME的活性,但随着浓度升高其增加幅度逐渐降低,当胰岛素浓度达到200nmol/L时,ME的活性受到抑制；葡萄糖和胰岛素的协同作用也促进ME的活性,其中100nmol/L胰岛素组的促进作用低于50nmol/L胰岛素组。(6)处理细胞24 h后,50nmol/L浓度胰岛素诱导DGAT1、DGAT2、CPT-1表达；FoxO1的mRNA表达在50nmol/L和100nmol/L的胰岛素影响下有明显的提高,当胰岛素浓度达到150nmol/L时,FoxO1的表达有所下降；MTP的表达同样被胰岛素促进,但是随着浓度的升高,促进作用减弱；ApoB、PEPCK表达受到胰岛素的抑制,而且胰岛素浓度越高,抑制效益越明显。葡萄糖对MTP的mRNA表达是抑制的；葡萄糖促进其他测定的葡萄糖代谢相关基因的表达,糖浓度越高,促进作用越明显。在胰岛素和葡萄糖协同作用中,50 nmol/L胰岛素处理下,无论低糖还是高糖,对葡萄糖代谢平衡相关基因的表达都有一定的诱导作用。而在100nmol/L胰岛素的处理下,相对与50nmol/L胰岛素处理而言,其他基因表达进一步上调,只有ApoB的表达有所抑制,而且高糖比低糖的抑制效应更强。(7)在葡萄糖处理中,胞外VLDL浓度与DGAT1、MTP基因表达呈显著正相关(P<0.05),胞内TG与DGAT2、PEPCK和FoxO1基因表达呈显著正相关(P<0.05)。在胰岛素处理中,胞外VLDL浓度与PEPCK表达呈显著正相关(P<0.05)。在胰岛素和葡萄糖协同处理中,胞外VLDL浓度与ApoB表达呈极其显著正相关(P<0.01),胞内TG浓度与DGAT2表达呈显著正相关(P<0.05)。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
前言  12
1 文献综述  12-22
  1.1 葡萄糖、脂肪酸代谢平衡概述  12-15
    1.1.1 肝细胞内葡萄糖代谢与胰岛素的作用  12-13
    1.1.2 肝细胞内脂肪酸代谢与胰岛素的作用  13-14
    1.1.3 肝细胞内脂质的沉积与分泌  14-15
  1.2 葡萄糖、脂肪酸代谢中相关基因研究进展  15-21
    1.2.1 PEPCK在糖异生中的作用  15-16
    1.2.2 FOXO1调控在糖异生中的作用  16-17
    1.2.3 CPT-1在脂肪酸氧化中的作用  17-18
    1.2.4 PPAR调控在脂肪酸氧化中的作用  18-19
    1.2.5 ME在脂肪酸合成中的作用  19-20
    1.2.6 MTP在脂蛋白分泌中的作用  20-21
  1.3 本研究的目的和意义  21-22
2. 材料与方法  22-35
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 实验动物  22
    2.1.2 主要仪器  22
    2.1.3 主要试剂盒与试剂  22-23
    2.1.4 主要试剂配制  23-24
  2.2 实验方法  24-35
    2.2.1 组织RNA的提取与相关基因的扩增  25-28
    2.2.2 序列的生物信息学分析  28
    2.2.3 胰岛素、葡萄糖及它们协同作用对鹅肝细胞相关指标的影响  28-32
    2.2.4 PEPCK、MTP、APOB、DGAT1/2、CPT-1和FOXO1等基因表达检测  32-34
    2.2.5 实验数据分析  34-35
3 结果与分析  35-47
  3.1 鹅PPARB、ME和PEPCK基因克隆  35-36
    3.1.1 组织总RNA提取和反转录产物检测  35
    3.1.2 目的基因扩增与克隆  35-36
  3.2 同源性分析与进化树的构建  36-39
    3.2.1 同源性分析  36-37
    3.2.2 目的基因分子进化树构建  37-39
  3.3 胰岛素和葡萄糖处理对鹅原代肝细胞活性的影响  39-40
    3.3.1 胰岛素对鹅原代肝细胞活性的影响  39
    3.3.2 葡萄糖对鹅原代肝细胞活性的影响  39-40
    3.3.3 胰岛素和葡萄糖协同对鹅原代肝细胞活性的影响  40
  3.4 胰岛素和葡萄糖对肝细胞内TG以及细胞分泌TG-VLDL的影响  40-43
  3.5 胰岛素和葡萄糖对相关基因表达影响  43-46
    3.5.1 各处理细胞总RNA的提取与反转录  43-44
    3.5.2 ME活性测定及变化曲线  44
    3.5.3 胰岛素和葡萄糖作用对相关基因MRNA表达的影响  44-46
  3.6 胰岛素和葡萄糖处理下肝细胞VLDL、胞内外TG浓度与葡萄糖代谢平衡相关基因表达的相关关系  46-47
4 讨论  47-52
  4.1 序列分析  47
  4.2 葡萄糖、胰岛素对鹅原代肝细胞活性的影响  47-48
  4.3 葡萄糖、胰岛素对糖异生代谢的影响  48
  4.4 葡萄糖、胰岛素对ME活性的影响  48-49
  4.5 葡萄糖、胰岛素对脂肪酸氧化的影响  49-50
  4.6 葡萄糖、胰岛素对DGAT1/2、FOXO1、MTP、APOB表达的影响  50-52
5 结论  52-53
参考文献  53-59
致谢  59-60
附录:硕士研究生学习期间参与科研项目及发表文章  60

葡萄糖和胰岛素对鹅肝细胞内葡萄糖代谢影响的研究

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