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稻瘟病菌81278ZB15 BAC克隆子805L15中7个假定分泌蛋白的功能分析

作　者: 陈春南
导　师: 鲁国东
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌无毒基因分泌蛋白
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 33次
引　用: 2次
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内容摘要

福建省稻瘟病菌菌株81278ZB15含Avr-Pi1、Avr-Pi2、Avr-Pi4a、Avr-Pi4b无毒基因簇,通过图位克隆技术定位在BAC克隆子805L15中,但其序列拼接不完整,仍有2个gap没有填补。本研究利用生物信息学软件分析805L15序列,共预测到48个基因,其中包含8个胞外分泌蛋白和1个GPI信号锚定蛋白。利用酵母同源重组技术构建了第1、8、16、23、32、37、43号基因的过量表达载体,并转入Guy11菌株的原生质体获得基因OE转化子;同时利用同源基因替换策略构建了第23号基因的敲除突变体。将这些稻瘟病菌突变体分别喷雾接种C101LAC Pi-1(t)、C101A51 Pi-2(t)、C104PKT Pi-3(t)、C101PKT Pi-4a、C105TTP-4L-23 Pi-4b、CO39近等基因系水稻品,结果表明,其毒性与野生型菌株Guy11一致,说明这些基因中并不含有无毒基因Avr-Pi1、Avr-Pi2、Avr-Pi4a。但是,对突变体其他表型的分析结果显示,8号基因OE转化子产孢量上升,43号基因OE转化子对洋葱表皮侵染能力下降而对水稻的致病能力不变,说明这两个基因分别与稻瘟病菌的产孢和侵染有关。鉴于上述结果,若要获得预期中的无毒基因,应重新拼接BAC克隆子805L15,得到其完整序列,并对81278ZB15中所含无毒基因进行重新预测。或者对无毒基因进行重新定位,获得新的BAC克隆子并进行基因预测,进行进一步研究。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
第一部分引言  10-25
  1.1 稻瘟病菌无毒基因  11-21
    1.1.1 无毒基因的功能  17-18
    1.1.2 稻瘟病菌无毒基因的研究策略  18-20
    1.1.3 无毒基因的研究意义  20-21
  1.2 分泌蛋白近期研究  21-23
    1.2.1 分泌蛋白的结构特征  21-22
    1.2.2 分泌蛋白分泌途径  22
    1.2.3 分泌蛋白的生物学作用  22-23
  1.3 预测分泌蛋白基因的功能分析在81278ZB15 无毒基因研究中的意义  23-25
    1.3.1 分泌蛋白与无毒基因的关系  23
    1.3.2 81278ZB15 中无毒基因簇Avr-Pi1、Avr-Pi2 和Avr-Pi4a 的定位  23-25
第二部分材料与方法  25-45
  2.1 供试菌株、质粒、试剂和培养基等材料  25-29
    2.1.1 供试稻瘟病菌菌株  25
    2.1.2 供试水稻  25-26
    2.1.3 供试质粒  26-29
  2.2 稻瘟病菌基因组DNA 的提取  29-30
  2.3 PCR 扩增  30-31
  2.4 OE 载体的构建  31-35
    2.4.1 编码假定分泌蛋白基因的ORF 扩增与PCR 产物的纯化  31
    2.4.2 小量质粒DNA 的制备  31-32
    2.4.3 pDL1 vector 的酶切  32
    2.4.4 酶切产物回收  32-33
    2.4.5 酵母同源重组  33-34
    2.4.6 酵母同源重组转化子质粒的提取  34
    2.4.7 大肠杆菌DH_(5α)超级感受态细胞的制备  34-35
    2.4.8 酵母质粒的转化  35
    2.4.9 大肠杆菌克隆子的验证  35
  2.5 敲除载体的构建  35-39
    2.5.1 A、B 片段的扩增  35-36
    2.5.2 A、B 片段的TA 克隆  36
    2.5.3 大肠杆菌DH_(5α)感受态细胞的制备  36-37
    2.5.4 连接产物的转化  37
    2.5.5 质粒酶切与连接  37-39
  2.6 稻瘟病菌的遗传转化  39-41
    2.6.1 稻瘟病菌原生质体的制备  39-40
    2.6.2 稻瘟病菌原生质体的转化  40
    2.6.3 稻瘟病菌原生质体转化子的验证  40-41
  2.7 稻瘟病菌总RNA 的提取  41-42
  2.8 cDNA的逆转录  42
  2.9 稻瘟病菌表型分析  42-44
    2.9.1 稻瘟病菌菌落生长速度测定  42
    2.9.2 分生孢子的培养  42-43
    2.9.3 产孢量统计及细胞形态观察  43
    2.9.4 孢子萌发及附着胞形成试验  43
    2.9.5 洋葱内表皮侵染观察  43-44
  2.10 稻瘟病菌致病性性测定  44-45
    2.10.1 育苗和接种方法  44
    2.10.2 病斑调查和定级  44-45
第三部分结果与分析  45-71
  3.1 BAC 克隆子805L15 中分泌蛋白的预测、筛选及其生物信息学分析  45-49
    3.1.1 BAC 克隆子805L15 中的基因预测  45-46
    3.1.2 BAC 克隆子805L15 中假定分泌蛋白生物信息学分析  46-49
  3.2 假定分泌蛋白基因的过量表达  49-63
    3.2.1 OE 载体的构建  49-52
    3.2.2 OE 转化子的获得及其验证  52-57
    3.2.3 OE 转化子表型分析  57-60
    3.2.4 OE 转化子致病性分析  60-63
  3.3 编码分泌蛋白基因的敲除  63-71
    3.3.1 编码分泌蛋白基因敲除载体的构建  63-64
    3.3.2 编码分泌蛋白基因敲除突变体的验证  64-67
    3.3.3 敲除突变体表型分析  67-69
    3.3.4 敲出突变体致病性分析  69-71
第四部分总结与讨论  71-74
  4.1 7 个假定分泌蛋白的功能与无毒基因无关  71
  4.2 BAC 克隆子805L15 拼接  71-72
  4.3 假定分泌蛋白的预测和筛选  72-73
  4.4 转化子表型的差异  73-74
参考文献  74-80
附录  80-83
  附录1. 培养基  80-82
  附录2. 生化试剂  82-83
致谢  83

稻瘟病菌81278ZB15 BAC克隆子805L15中7个假定分泌蛋白的功能分析

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