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从中药中高通量筛选P-糖蛋白抑制剂的研究

作　者: 冯璐璐
导　师: 李发荣
学　校: 陕西师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 多药耐药 P-糖蛋白 Caco-2细胞 中药
分类号: R287
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一,化疗是治疗肿瘤的最主要手段。然而肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance, MDR)的产生是目前肿瘤化学治疗失败的一个主要原因。如何逆转多药耐药成为提高化疗疗效的亟待解决的问题。导致MDR的原因很多,其中以P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药研究最为深入。目前对于肿瘤多药耐药逆转剂的开发多是以P-糖蛋白作为靶标。本实验制备多种中药的提取物,利用Caco-2细胞高表达P-糖蛋白的特点,建立Caco-2细胞高通量筛选模型,从不同中药提取物中筛选能有效抑制P-糖蛋白“外泵”作用的药物。并对几种阳性药物对P-糖蛋白的抑制作用进行初步验证。方法：(1)培养Caco-2细胞,以Rho-123为荧光探针,建立高通量筛选P-糖蛋白中药抑制剂的Caco-2细胞模型。并通过检测细胞内Rho-123荧光蓄积量的变化初步筛选出抑制P-糖蛋白的阳性中药；(2)将初筛得到的几种阳性中药提取物对P-糖蛋白抑制作用进行验证：Rho-123蓄积实验评价药物对P-糖蛋白“外泵”功能的抑制作用(采用多功能酶标仪和流式细胞仪两种检测手段)；MTT法检测药物与ADM联合作用后对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测药物对细胞内ADM蓄积量的影响。结果：(1)建立了从中药中高通量筛选P-糖蛋白抑制剂的Caco-2细胞模型,从17种中药提取物中初步筛选P-糖蛋白抑制剂,并确定以L1、D2、S3提取物为研究对象进行后续实验研究；(2)通过MTT法发现不同的浓度L1、D2、S3提取物作用于Caco-2细胞后,细胞抑制率随浓度的提高而增加,而且当L1、D2提取物在浓度<0.125μg/mL、S3提取物在浓度<0.0625μg/mL时,不会对细胞增殖产生显著影响,为非细胞毒性剂量。(3)Rho-123蓄积实验证明L1、D2、S3提取物可增加细胞内Rho-123的荧光强度。通过多功能酶标仪检测发现,随着中药提取物浓度的升高,细胞内的荧光强度也随之增加,当L1、D2浓度为62.5ng/mL、125ng/mL时,可显著的增加细胞内Rho-123的蓄积(P<0.05), S3在31.25ng/mL、62.5ng/mL浓度下,可极显著的增加细胞内Rho-123的蓄积(P<0.01)。流式细胞仪检测显示125ng/mL的L1、D2提取物作用后细胞内Rho-123的荧光强度与阴性相比显著的增强,62.5ng/mL浓度的S3也可增加细胞内Rho-123荧光强度。(4)MTT法检测发现62.5ng/mL、125ng/mL的L1、D2,31.25、62.5ng/mL S3提取物与抗癌药物ADM联合作用后可显著的增加ADM对细胞增殖的抑制作用,增加化疗敏感性。(5)125ng/mL的L1、D2、62.5ng/mL的S3提取物与细胞作用后使细胞内ADM蓄积量增加。结论：Caco-2细胞模型是一种可高通量筛选P-糖蛋白中药抑制剂的有效模型。L1、D2、S3提取物对Caco-2细胞的P-糖蛋白有显著的抑制作用,可显著的提高Caco-2细胞对抗癌药物的敏感性。提示L1、D2、S3可能为P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药的有效逆转剂。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-10
第1章 前言  10-22
  1.1 多药耐药产生机制  10-12
    1.1.1 肿瘤细胞内药物积聚减少  10-11
    1.1.2 药物靶标的改变  11
    1.1.3 细胞凋亡的抑制  11-12
  1.2 P-糖蛋白结构和功能  12-14
    1.2.1 P-糖蛋白结构  12-13
    1.2.2 P-糖蛋白功能  13
    1.2.3 P-糖蛋白作用机制  13-14
  1.3 P-糖蛋白介导的多药耐药的逆转策略  14-15
    1.3.1 抑制P-糖蛋白的功能  14-15
    1.3.2 抑制P-糖蛋白的表达  15
    1.3.3 增强细胞免疫功能从而抑制P-糖蛋白  15
  1.4 筛选P-糖蛋白抑制剂的研究方法  15-18
    1.4.1 药物的蓄积和外排实验  15-16
    1.4.2 ATP酶测定法  16
    1.4.3 单克隆抗体技术  16
    1.4.4 核酶技术  16-17
    1.4.5 反义寡核苷酸技术  17
    1.4.6 RNA干扰技术  17
    1.4.7 反义RNA技术  17-18
  1.5 P-糖蛋白中药抑制剂研究进展  18-20
    1.5.1 从中药中筛选P-糖蛋白抑制剂的优势  18
    1.5.2 单味药  18-19
    1.5.3 中药复方  19
    1.5.4 其他  19-20
  1.6 本课题研究的内容和意义  20-22
    1.6.1 本课题研究的目的  20
    1.6.2 本课题研究的意义  20-22
第2章 Caco-2细胞高通量筛选模型的建立  22-32
  2.1 材料与仪器  23-25
    2.1.1 材料与试剂  23-24
    2.1.2 仪器设备  24-25
  2.2 实验方法  25-28
    2.2.1 溶液的配制  25-26
    2.2.2 中药提取物的制备  26
    2.2.3 Caco-2细胞模型的建立  26-27
    2.2.4 罗丹明-123蓄积实验  27
    2.2.5 统计分析  27-28
  2.3 结果与讨论  28-32
    2.3.1 中药提取物制备  28-29
    2.3.2 罗丹明-123蓄积实验  29-32
第3章 L1、D2和S3提取物对P-糖蛋白抑制作用的初步验证  32-46
  3.1 材料与仪器  32-33
    3.1.1 材料试剂  32
    3.1.2 仪器设备  32-33
  3.2 方法  33-35
    3.2.1 溶液的配制  33
    3.2.2 细胞培养  33
    3.2.3 细胞毒性检测  33-34
    3.2.4 L1、D2、S3提取物对细胞内Rho-123蓄积的影响  34
    3.2.5 L1、D2、S3提取物与ADM联用后对细胞增殖的影响  34-35
    3.2.6 L1、D2、S3提取物对细胞内ADM蓄积的影响  35
    3.2.7 统计分析  35
  3.3 结果及讨论  35-46
    3.3.1 细胞毒性检测  35-36
    3.3.2 L1、D2、S3提取物对细胞内Rho-123蓄积的影响  36-38
    3.3.3 流式细胞仪检测结果  38-40
    3.3.4 L1、D2和S3与ADM联合作用后对细胞增殖的影响  40-43
    3.3.5 L1、D2和S3提取物对细胞内ADM蓄积的影响  43-46
第4章 总讨论  46-48
第5章 总结  48-50
参考文献  50-61
致谢  61-62
硕士期间研究成果  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 各科用药
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