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CSN1S2、CSN2、CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析

作　者: 李玲
导　师: 曹斌云
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 差异表达基因实时荧光定量乳腺组织奶山羊
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

酪蛋白是乳中特有的蛋白,可以分为五种:αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、β-酪蛋白(CSN2)、γ-酪蛋白和k-酪蛋白(CSN3)。酪蛋白含有几乎全部的必需氨基酸,是唯一可凝固的乳蛋白,可与钙、磷形成稳定的微胶粒而提高对乳中钙磷含量的吸收。因此,酪蛋白是新生幼仔最具营养价值的蛋白质,对新生动物的健康和生长发育起到非常重要的调节作用。随着基因结构和功能研究的深入,人们逐渐认识到奶山羊泌乳性能的个体差异最终决定于其自身基因的差异表达。乳腺规律性的生理变化直接影响奶山羊泌乳期的长短、乳成分的变化和泌乳量的高低。因此,本试验以西农萨能奶山羊泌乳中期的乳腺组织为试验材料,采用实时定量的方法检测CSN1S2基因、CSN2基因和CSN3基因的表达量,分析其与泌乳性状的关系,并对目的基因进行克隆和鉴定。本试验旨在发现对奶山羊泌乳量有显著影响的基因,为奶山羊的选育提供理论和实践参考依据。主要获得以下结果:1 CSN1S2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析与克隆鉴定以看家基因β-actin为内参对CSN1S2基因进行相对定量PCR分析,结果表明:CSN1S2基因在第1组山羊(泌乳量:1100.00±15.00kg)乳腺组织中的mRNA平均表达量是第2组山羊(泌乳量:600.00±12.00kg)的2.47倍;对两组山羊乳的乳成分分析表明:第1组山羊乳中蛋白质含量是第2组的1.05倍,差异显著(P<0.05);第2组山羊乳中脂肪含量是第1组的1.18倍,差异不显著(P>0.05)。对CSN1S2表达片段进行克隆测序,发现差异表达片段与山羊CSN1S2基因的核苷酸序列同源性为99%,验证了差异表达片段就是目的片段;同时发现在目的片段的64bp处发现了一个C→T的碱基突变,推测CSN1S2表达量的增高可能和碱基突变有关。2 CSN2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析与克隆鉴定以看家基因β-actin为内参对CSN2基因进行相对定量PCR分析,结果发现:CSN2在第1组山羊(泌乳量:1100.00±15.00kg)乳腺组织中的mRNA平均表达量是第2组山羊(泌乳量:600.00±12.00kg)的5.48倍;由相关性分析可知,CSN2基因的表达量与产奶量呈正相关(P<0.05);对差异表达片段进行克隆测序,发现差异表达的片段与山羊CSN2基因的核苷酸序列同源性为100%,验证了引物的特异性和表达片段的正确性。3 CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析与克隆鉴定以看家基因β-actin为内参对CSN3基因进行相对定量PCR分析,结果发现:CSN3基因在第1组(泌乳量:1100.00±15.00kg)的西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量是第2组(泌乳量:600.00±12.00kg)的3.10倍,差异极显著(P<0.01)。由相关性分析可知,CSN3基因的表达量与蛋白质呈正相关(P<0.05),与产奶量和脂肪含量相关性较小,不显著(P>0.05)。对差异表达片段进行克隆测序,发现差异表达的片段与山羊CSN3基因的核苷酸序列同源性为100%,验证了引物的特异性和表达片段的正确性。通过以上研究表明,CSN1S2、CSN2和CSN3基因可作为奶羊泌乳性状选育的候选基因。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-29
  第一章泌乳和乳蛋白的研究进展  12-17
    1.1 泌乳量和乳成分的变化  12
    1.2 乳腺上皮细胞的分泌途径  12
    1.3 乳脂肪的组成与变化  12-13
    1.4 酪蛋白的分类与变化  13-14
    1.5 乳铁蛋白的作用  14-15
    1.6 乳白蛋白的功能  15-16
    1.7 乳球蛋白的作用  16-17
  第二章基于PCR 的基因差异表达分析技术  17-25
    2.1 mRNA 差异显示分析技术  17
    2.2 代表性差异显示分析技术  17-18
    2.3 基因表达系列分析技术  18-19
    2.4 抑制性消减杂交  19-20
    2.5 DNA 微阵列  20
    2.6 实时荧光定量PCR  20-25
  第三章新基因功能预测的理论及方法  25-28
    3.1 新基因及其功能的预测  25-26
    3.2 蛋白质结构与功能预测及方法  26-28
  第四章本研究的目的及意义  28-29
实验部分  29-70
  第五章 CSN1S2 基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析与克隆鉴定  29-46
    5.1 引言  29
    5.2 材料与方法  29-37
      5.2.1 主要仪器  29-30
      5.2.2 引物的设计与合成  30
      5.2.3 实时定量PCR 分析  30-34
      5.2.4 CSN1S2 基因片段的克隆  34-37
    5.3 结果与分析  37-43
      5.3.1 奶山羊乳腺组织中总RNA 的提取及检测  37
      5.3.2 常规PCR 鉴定和引物质量的评价  37
      5.3.3 Real time PCR 的相关曲线  37-40
      5.3.4 CSN1S2 基因实时定量结果  40-41
      5.3.5 CSN1S2 基因的表达量及其与产奶性状的相关性分析  41-42
      5.3.6 CSN1S2 基因差异表达片段的序列分析  42-43
    5.4 讨论  43-44
      5.4.1 实时定量PCR  43-44
      5.4.2 CSN1S2 基因  44
    5.5 小结  44-46
  第六章 CSN2 基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达情况分析与克隆鉴定  46-58
    6.1 引言  46
    6.2 材料与方法  46-50
      6.2.1 主要仪器  46
      6.2.2 引物设计与合成  46
      6.2.3 实时定量PCR 分析  46-49
      6.2.4 基因克隆  49-50
    6.3 结果与分析  50-54
      6.3.1 奶山羊乳腺组织中总RNA 的提取及检测  50
      6.3.2 目的基因的扩增及引物特异性的检验  50
      6.3.3 Real time PCR 的相关曲线  50-52
      6.3.4 实时定量结果  52-53
      6.3.5 CSN2 基因的表达量及其与产奶性状的相关性分析  53
      6.3.6 测序及同源性分析  53-54
    6.4 讨论  54-57
      6.4.1 2-△△CT 方法的推导  54-56
      6.4.2 CSN2 基因  56-57
    6.5 小结  57-58
  第七章 CSN3 基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析与克隆鉴定  58-68
    7.1 引言  58
    7.2 材料与方法  58-61
      7.2.1 主要仪器和试剂  58
      7.2.2 引物的设计与合成  58
      7.2.3 实时定量PCR 分析  58-60
      7.2.4 基因克隆  60-61
    7.3 结果与分析  61-65
      7.3.1 奶山羊乳腺组织中总RNA 的提取及检测  61
      7.3.2 引物质量的评价和常规 PCR 鉴定  61
      7.3.3 Real time PCR 的相关曲线  61-63
      7.3.4 CSN3 基因实时定量结果  63-64
      7.3.5 CSN3 基因的表达量及其与产奶性状的相关性分析  64
      7.3.6 测序及同源性分析  64-65
    7.4 讨论  65-66
      7.4.1 基因克隆  65
      7.4.2 CSN3 基因  65-66
    7.5 小结  66-68
  第八章结论、创新点及下一步研究计划  68-70
    8.1 结论  68
    8.2. 研究的创新点  68-69
    8.3.下一步研究计划  69-70
参考文献  70-77
致谢  77-78
作者简介  78

CSN1S2、CSN2、CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析

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