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秦岭大熊猫IL-2基因的克隆、原核表达及表达产物的生物活性研究

作　者: 乔琦
导　师: 陈德坤
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 秦岭大熊猫白细胞介素-2 克隆和核表达 ELISA 生物活性
分类号: S865.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大熊猫是我国珍稀的野生动物,全球仅存1600多只,尤其是秦岭种群大熊猫的数量据第3次野外普查报告总数仅有273左右。大熊猫人工繁育中,因疾病尤其传染病引起的大熊猫发育不良和死亡是目前大熊猫繁育饲养中的主要问题之一,提高大熊猫免疫力无疑是提高大熊猫抗病力从而降低人工繁育饲养过程中死亡率的根本手段。提高大熊猫免疫力首先要解决的问题是弄清大熊猫免疫系统各成分的免疫特性,建立大熊猫免疫信息库。由于大熊猫数量限制等因素,这一工作进展较为缓慢,大熊猫GenBank中的数据亟待充实,尤其是秦岭种群大熊猫的免疫资料还是空白。鉴于IL-2不仅在免疫系统中是一个十分关键的细胞因子,并且在临床疾病预防和治疗中的重要作用已经充分的证实,我们开展本研究克隆了秦岭大熊猫IL-2基因并建立了原核表达体系表达出具有生物活性的秦岭大熊猫IL-2蛋白。根据GenBank上发表的大熊猫白细胞介素-2序列( Genbank accession DQ85233)设计2对特异性引物,在引物的上下游引物分别带有BamH错误!未找到引用源。、HindⅢ酶切位点。通过RT-PCR从ConA诱导培养的成年秦岭大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到约468bp的大熊猫IL-2基因,并将其克隆到pGEM-T载体中,构建克隆质粒pGEM-T-IL-2。用相同的限制性内切酶酶切阳性质粒pGEM-T-IL-2和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主菌BL21(DE3),经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体,用不同浓度的IPTG诱导表达IL-2蛋白主要抗原区基因,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为32ku。经过对表达条件的优化,最后确定以37℃培养至OD600达0.6左右,加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L,再以25℃继续培养12 h,这样的培养条件下表达量最大,经分析表达蛋白量约占菌体蛋白的30%。表达产物经Western-blot分析,检测确认表达产物为带6个组氨酸标签的融合大熊猫IL-2。目的蛋白经大量诱导表达,可溶性试验证明重组蛋白以可溶性形式存在于诱导菌液上清中,本实验用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目的蛋白。用纯化的重组蛋白进行兔多克隆抗体制备和体外活性检测,用ELISA检测兔血中的多克隆抗体,结果为阳性,表达产物具有良好的抗原性。MTT法进行重组蛋白的体外活性检测,结果表明重组蛋白具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章大熊猫疾病和IL-2 相关研究进展  11-26
  1.1 大熊猫免疫相关疾病研究进展  11-20
    1.1.1 大熊猫细菌病的种类及危害  11-14
    1.1.2 大熊猫病毒病研究进展  14-17
    1.1.3 大熊猫寄生虫病研究进展  17-19
    1.1.4 其他大熊猫疾病研究  19
    1.1.5 大熊猫疾病临床治疗药物疗效及药物副作用评估  19-20
  1.2 大熊猫免疫相关研究进展  20-21
  1.3 IL-2 的研究进展及临床应用  21-23
    1.3.1 IL-2 的研究进展  21
    1.3.2 IL-2 的临床应用  21-23
  1.4 动物IL-2 克隆表达及临床应用进展  23-25
    1.4.1 IL-2 基因相关研究进展  23
    1.4.2 IL-2 的临床应用  23-25
  1.5 选题的目的和意义  25-26
第二章秦岭大熊猫IL-2 基因克隆和大肠杆菌中的表达  26-46
  2.1 材料  26-30
    2.1.1 试验动物  26
    2.1.2 菌种和载体  26
    2.1.3 主要试剂  26
    2.1.4 主要仪器  26-27
    2.1.5 主要溶液和配方  27-30
  2.2 方法  30-39
    2.2.1 秦岭大熊猫IL-2 的基因克隆  30-31
    2.2.2 克隆载体pGEM-T-IL-2 的构建  31-35
    2.2.3 原核表达载体pET32a-IL-2 的构建  35-37
      2.2.3.1 阳性质粒和表达载体的酶切和回收  35
      2.2.3.2 目的片段和表达载体的连接  35-36
      2.2.3.3 BL21 感受态的制备  36-37
      2.2.3.4 连接产物的转化  37
      2.2.3.5 重组质粒的鉴定  37
    2.2.4 重组质粒的诱导表达  37
    2.2.5 表达条件的优化  37-38
    2.2.6 表达产物的存在形式检测  38
    2.2.7 表达产物的检测  38-39
  2.3 结果  39-43
    2.3.1 RT-PCR 结果  39-40
    2.3.2 重组质粒pGEM-T-IL-2 的鉴定  40
    2.3.3 序列测定分析  40-41
    2.3.4 重组表达载体的鉴定  41-42
    2.3.5 表达产物的SDS-PAGE 检测  42
    2.3.6 表达条件的优化  42
    2.3.7 表达蛋白的存在形式检测  42-43
    2.3.8 表达产物的wetern-blot 分析  43
  2.4 讨论  43-46
第三章抗IL-2 多克隆抗体的制备和生物活性鉴定  46-55
  3.1 材料  46-48
    3.1.1 实验动物  46
    3.1.2 主要试剂  46
    3.1.3 主要仪器设备  46
    3.1.4 主要溶液配制  46-48
  3.2 方法  48-51
    3.2.1 纯化重组蛋白制备抗原  48-50
    3.2.2 大熊猫IL-2 多克隆抗体制备  50
    3.2.3 重组蛋白IL-2 生物活性鉴定  50-51
  3.3 结果  51-53
    3.3.1 重组蛋白的纯化  51-52
    3.3.2 多克隆抗体的制备  52
    3.3.3 重组蛋白IL-2 对淋巴细胞转化增殖的作用的特异性试验结果  52-53
  3.4 讨论  53-55
    3.4.1 目的蛋白的纯化  53
    3.4.2 大熊猫IL-2 多克隆抗体制备  53-54
    3.4.3 抗IL-2 抗体的检测  54
    3.4.4 重组蛋白的生物活性鉴定  54-55
结论  55-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
作者简介  62

秦岭大熊猫IL-2基因的克隆、原核表达及表达产物的生物活性研究

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