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一个新型细菌单杂交系统报告载体的构建及其在转录因子发现中的应用

作　者: 冯辉
导　师: 何正国
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 蛋白质-DNA相互作用细菌单杂交系统媒介DNA 毒力分泌蛋白
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

蛋白质和核酸是生命体最为重要的两类生物大分子。基因的表达调控特别是转录调控主要体现为蛋白质与DNA分子间特异性的相互作用。因此，发展有效的DNA-蛋白质相互作用分析技术对于深入理解基因的转录调控机制和发掘新功能基因具有重要意义。近年来，以生物大分子间亲和力为基础的筛选策略已被广泛应用于鉴定蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA分子间的相互作用。本课题基于募集RNA聚合酶实现转录激活这一基本原理，以商业化的细菌双杂交系统诱饵载体pBT为基础，成功构建了能用于分析蛋白质-DNA相互作用的细菌单杂交(B1H)筛选报告载体pBXcmT，并将其应用于筛选和鉴定与结核分支杆菌毒力基因CFP-10上游调控序列相互作用的潜在转录因子。本研究取得了以下几个方面的研究结果：①以细菌双杂交系统报告菌株总DNA为模板，PCR扩增获得了约1.7 kb的His3-aadA报告基因片段，并进行了测序验证；②将pBT载体中λcⅠ和lac-UV5启动子切除，末端处理后自连环化，然后将上面获得的His3-aadA报告基因片段定向克隆到该载体中构建了初始报告载体pRpb；③为了有效抑制自激活，降低筛选背景，通过构建和筛选部分基因文库，在pRpb报告基因上游成功引入间隔DNA插入片段，经过进一步酶切位点修饰，获得了衍生报告载体pRpb-S7；④构建了包含有两个XcmI位点的媒介DNA片段引入到衍生报告载体pRpb-S7的多克隆位点，成功构建成报告载体pBXcmT，该载体经过XcmI酶切后产生的T-载体可用于目的DNA PCR产物的快速克隆；⑤将结核分支杆菌H37Rv毒力蛋白CFP-10基因上游的调控序列克隆到pBXcmT报告基因His3-aadA上游，产生的重组质粒通过筛选病原菌基因文库，共获得了4个与该调控序列存在相互作用的潜在转录因子。因此，本研究基于商业化载体pBT成功构建了一个新的细菌单杂交报告载体，该载体不仅无自激活背景，而且在多克隆位点引入了方便的PCR产物克隆策略。与pTRG文库载体配合使用，该系统不仅可以鉴定和发现新的转录因子，而且也能通过已知的转录因子反向筛选其特异识别的DNA靶序列。本研究中新型细菌单杂交系统的构建对于发掘新功能基因及其识别的靶DNA位点具有广泛的应用前景。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
第一章文献综述  11-22
  1 研究生物大分子之间相互作用的意义  11
  2 蛋白质-DNA相互作用的研究  11-18
    2.1 酵母单杂交系统  11-14
      2.1.1 酵母单杂交系统产生的背景  11-12
      2.1.2 酵母单杂交系统的工作原理  12
      2.1.3 酵母单杂交系统的应用  12
      2.1.4 酵母单杂交系统的研究进展  12-13
      2.1.5 酵母单杂交系统的优缺点  13-14
    2.2 细菌单杂交系统  14-16
      2.2.1 细菌单杂交系统产生的背景  14-15
      2.2.2 细菌单杂交系统的工作原理  15
      2.2.3 细菌单杂交系统的进展及应用  15-16
      2.2.4 细菌单杂交系统的优缺点  16
    2.3 用于研究蛋白质-DNA相互作用的其他方法  16-18
      2.3.1 SELEX技术  16-17
      2.3.2 基因芯片技术  17
      2.3.3 凝胶阻滞实验  17
      2.3.4 足迹实验  17
      2.3.5 噬菌体展示技术  17
      2.3.6 染色质免疫沉淀技术  17-18
  3 结核分支杆菌基因转录调控的研究  18-20
    3.1 结核分支杆菌转录调控的研究现状及进展  18-20
    3.2 研究ESAT-6、CFP-10转录调控的意义  20
  4 本课题的意义、内容和研究目标  20-22
    4.1 研究意义及基本设想  20-21
    4.2 主要技术路线  21
    4.3 主要研究内容  21
    4.4 本研究的目标  21-22
第二章实验材料和方法  22-30
  1 试验材料  22-26
    1.1 供试菌株和质粒  22
      1.1.1 实验所用菌株  22
      1.1.2 实验所用质粒  22
    1.2 抗生素  22
    1.3 培养基  22-25
    1.4 试剂及溶液配制  25-26
    1.5 酶与标准分子量  26
  2 试验方法  26-30
    2.1 分子生物学基本操作  26
    2.2 E.coli XL1-Blue总DNA提取  26-27
    2.3 S.solfataricus P2不完全酶切基因文库构建  27
    2.4 DNA-蛋白质相互作用检测  27-28
      2.4.1 筛选培养基的配制方法  27
      2.4.2 点种及培养方法  27-28
      2.4.3 筛选平板生长情况的观察  28
    2.5 酶切位点修饰与载体多克隆位点改造  28-29
      2.5.1 酶切位点修饰  28-29
      2.5.2 多克隆位点改造  29
    2.6 共转化子的制备与筛选  29
    2.7 共转化子中质粒的分离与鉴定  29-30
第三章载体的构建及应用研究结果  30-49
  1 细菌单杂交系统报告载体的构建  30-46
    1.1 His3-aadA目的片段的获得  30-33
      1.1.1 E.coli XL_1-Blue报告菌株总DNA提取  30
      1.1.2 His3-aadA目的片段PCR扩增  30
      1.1.3 His3-aadA目的片段内部BamHI位点消除  30-33
    1.2 带有His3-aadA目的片段的初始报告载体构建  33
    1.3 初始报告载体功能验证  33-36
      1.3.1 重组报告载体的构建  34-35
      1.3.2 重组pTRG表达载体构建  35
      1.3.3 共转化菌株构建  35
      1.3.4 相互作用检测  35-36
    1.4 初始报告载体功能分析及改造策略  36-41
      1.4.1 His3-aadA序列上游随机片段间隔文库的准备  36-37
      1.4.2 共转化菌株构建及初筛  37-38
      1.4.3 共转化菌株复筛  38
      1.4.4 目的共转化菌株的质粒分离及测序  38-39
      1.4.5 报告载体酶切位点修饰  39-41
    1.5 报告载体多克隆位点改造  41-42
      1.5.1 含有双XcmI位点的媒介DNA片段的制备  41-42
      1.5.2 pBXcmT载体构建  42
    1.6 报告载体的功能验证  42-46
      1.6.1 S.solfataricus复制原点Oril引入报告基因上游  42-45
      1.6.2 共转化菌株构建  45
      1.6.3 相互作用检测  45-46
  2 报告载体在鉴定结核分支杆菌新型转录因子中的应用  46-49
    2.1 3874R引入报告基因上游  46
    2.2 转录因子表达文库的准备  46
    2.3 共转化菌株的准备  46-47
    2.4 筛选共转化菌株,鉴定新的蛋白质-DNA相互作用  47-48
    2.5 具备相互作用的共转化菌株质粒分离及测序  48-49
第四章总结和讨论  49-59
  1 总结  49-50
  2 讨论  50-59
附录测序结果  59-62
致谢  62

一个新型细菌单杂交系统报告载体的构建及其在转录因子发现中的应用

内容摘要

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