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金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究

作　者: 张亚伟
导　师: 陈素华
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 金叶败毒颗粒药物血清人巨细胞病毒日本大耳白兔细胞毒性抗病毒吸附穿入复制
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

【目的】通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）法分别检测金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒（HCMV）感染吸附、穿入、复制三环节的活性,探讨金叶败毒颗粒抗HCMV感染的作用机制。【方法】1.细胞悬液法原代培养人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast, HEL）。2. HCMV AD169毒株体外细胞培养法传毒增殖,Reed-Muench法计算病毒半数细胞感染量TCID50。3.制备金叶败毒颗粒药物血清:①将正常成年雌性日本大耳白兔按体重随机分为低、中、高剂量组和空白对照组四组,每组3只;低、中、高剂量组给药量分别为1.5g/Kg、3g/Kg、6g/Kg,相当于成人每次每公斤体重用药剂量的5倍、10倍、20倍,用温双蒸水50ml溶解药物,空白对照组给予等体积的双蒸水;②低、中、高剂量组灌服相应剂量金叶败毒颗粒,空白对照组灌服等体积的双蒸水,每天上、下午各一次,连续3天,第4天上午给药后1h、1.5h、2h、2.5h、3h于兔耳中央动脉采血,血静置2h,3000rpm离心20min,取上层淡黄色透明样血清,56℃水浴灭活30min,一次性滤器过滤除菌,-80℃低温冰箱保存备用;③使用前将所需剂量的血清从-80℃取出,37℃水浴解冻,用细胞维持液将药物血清配置为5%、10%、20%、药物血清-DMEM培养液。4.金叶败毒颗粒药物血清细胞毒性检测:将HEL细胞悬液以1×105 /ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5% CO₂培养箱培养24小时,用各组药物血清-DMEM培养液干预细胞,细胞病变法（Cytopathogenic Effect, CPE）观察细胞形态变化,MTT法检测OD值,筛选出无细胞毒性的药物血清-DMEN培养液。5.金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测:将HEL细胞悬液以1×105 /ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5% CO₂培养箱培养24小时,先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、筛选出的无细胞毒性的药物血清-DMEM培养液干预细胞,CPE法观察细胞形态变化,MTT法检测OD值,计算病毒抑制率,筛选出抗病毒活性最高的药物血清-DMEM培养液。6.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV吸附、穿入、复制影响的实验研究:将HEL细胞悬液以1×105 /ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5% CO2培养箱培养24小时,利用同步感染法（Synchronized infection assays）,先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、抗病毒活性最高的药物血清-DMEM培养液干预细胞,CPE法观察细胞形态变化,MTT法检测OD值,计算病毒抑制率,评价金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV感染吸附、穿入、复制三环节的活性。【结果】1. HCMV AD169毒株半数细胞感染量为10-3.4/100ul。2.金叶败毒颗粒药物血清细胞毒性检测:①低剂量组药物血清:分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%药物血清-DMEM培养液和1h、1.5h采血配置的20%药物血清-DMEM培养液无细胞毒性,与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p>0.1）。②中剂量组药物血清:分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%药物血清-DMEM培养液和1h、1.5h采血配置的20%药物血清-DMEM培养液无细胞毒性,与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p>0.1）。③高剂量组药物血清:分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5%、10%药物血清-DMEM培养液和1h采血配置的20%药物血清-DMEM培养液无细胞毒性,与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p>0.1）。3.金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测:①中、高剂量组药物血清具有较高的抗HCMV作用,与病毒对照组比较差异有显著性意义（p<0.01）,中剂量组、1.5h、5%药物血清的病毒抑制率达90.90%;②随时间变化,药物血清的抗HCMV作用在1.5h、2h两个采血时相达到高峰,1.5h与2h药物血清组的抗HCMV作用相当,比较差异无显著性意义（p>0.1）;③采血时相为1.5h、2h时,中、高两种剂量组药物血清抗HCMV的作用相当,比较差异无显著性意义（p>0.1）;4.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV吸附、穿入、复制影响的实验研究:金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV感染吸附、穿入、复制三阶段的病毒抑制率分别为40.43%、37.55%、88.84%,与病毒对照组比较差异有显著性意义（p<0.01）,其中抗HCMV复制的活性最强。【结论】1.药物血清制备的最佳给药剂量为中剂量（3g/Kg）,最佳采血时间为1.5h,体外反应体系中药物血清最佳稀释度为5%; 2.金叶败毒颗粒药物血清具有抗HCMV感染的作用;3.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV感染的吸附、穿入、复制三阶段均有抑制作用;4.金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV复制的作用最强。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-13
第一部分人胚肺成纤维细胞原代培养  13-16
  材料和方法  13-15
  结果  15-16
第二部分 HCMV 扩增及感染性滴度测定  16-19
  材料和方法  16-18
  结果  18-19
第三部分金叶败毒颗粒药物血清制备  19-21
  一、主要实验器材与试剂  19-20
  二、动物实验  20-21
第四部分金叶败毒颗粒药物血清细胞毒与抗病毒实验研究  21-31
  材料和方法  21-23
  结果  23-31
第五部分金叶败毒颗粒药物血清对HCMV 吸附、穿入、复制影响的实验研究  31-34
  材料和方法  31-33
  结果  33-34
讨论  34-38
参考文献  38-40
综述  40-48
  参考文献  45-48
致谢  48

金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究

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