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外源基因清除技术（Gene-deletor）在转基因油菜中的应用研究

作　者: 徐漫
导　师: 赵德刚
学　校: 贵州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘蓝型油菜环境安全性遗传转化转基因植株外源基因清除
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来,全球转基因油菜大面积种植带来的环境安全性问题已成为人们关注的焦点。为解决转基因油菜花粉飘逸可能造成的安全性威胁,本论文以构建的外源基因清除表达载体遗传转化甘蓝型油菜(Brassica napus), pBin 19-LF-LAT59-FLP-NOS-35S-GUS:NPTⅡ-NOS-35S-GFP-NOS-LF,该载体以番茄花粉特异启动子LAT59驱动重组酶FLP基因表达,以CaMV35S启动子分别驱动报告基因GUS、GFP以及筛选基因NPTⅡ表达。以pBin1935S-GUS:NPTⅡ-NOS载体为对照载体。探索外源基因清除技术在油菜转基因研究中的可行性,期望培育出花粉中无外源基因的转基因油菜,为转基因油菜育种打下基础。取得如下研究结果：(1)以甘蓝型油菜品种特选四号下胚轴和花柄为受体,采用农杆菌介导法进行油菜遗传转化。转化的pBin19-LAT59-FLP载体中,289个花柄切段获得抗卡那霉素(Km)抗性植株15株,935个下胚轴切段获得抗性植株75株,通过报告基因GUS分析及PCR检测鉴定,获得转基因油菜株系22株；转化的pBin19-35S-GUS载体中,获得10株抗性植株,但未鉴定出转基因植株。(2)以1%醋酸洋红对转基因植株、野生型植株和经组织培养获得的对照植株花粉进行染色。检测后发现花粉活力分别为95.45%、97.90%、98.79%,t检验结果表明：转基因植株花粉活力分别比组培植株花粉活力、野生型植株花粉活力低,差异达显著水平,而组培植株花粉活力与野生型植株花粉活力差异不显著。(3)在转基因植株花粉发育减数分裂期、四分体期、单核期、双核期、成熟期进行GUS染色,发现花粉减数分裂期、四分体期、单核期、双核期仍有GUS蛋白表达。在花粉成熟期,对10株转基因植株成熟花粉进行GUS染色,每株取10朵花,共29509粒花粉中没有观察到有蓝色花粉,证明外源基因已从花粉中完全清除,而不含有删除系统的转基因油菜花粉GUS组织化学染色是蓝色。(4)转基因植株外源基因清除效率分析,分别对转基因植株自交、转基因植株为母本与野生型植株为父本杂交、转基因植株为父本与野生型植株为母本杂交,收获种子后在培养皿中发芽,以幼芽进行GUS组织化学染色,结果表明,9个独立的转基因油菜株系花粉中外源基因清除效率为10.20%-100%,其中6个株系清除效率达到100%。本研究采用花粉特异启动子LAT59驱动重组酶基因FLP表达,首次证明外源基因清除系统可以在油菜花粉成熟期清除转基因油菜中的外源基因,最高清除效率达到100%,利用外源基因清除技术可以解决转基因油菜的环境安全性问题。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
第一部分文献综述  9-23
  1.转基因油菜的研究进展  9-17
    1.1 油菜遗传转化方法  9-12
      1.1.1 农杆菌介导法  9-10
      1.1.2 基因枪法  10
      1.1.3 PEG法  10
      1.1.4 激光微束穿刺法  10-11
      1.1.5 花粉管通道法  11
      1.1.6 in planta转化法  11-12
    1.2 油菜遗传转化受体  12-13
      1.2.1 下胚轴、子叶受体  12
      1.2.2 花药受体  12-13
      1.2.3 小孢子、茎段受体  13
    1.3 油菜遗传转化基因  13-15
      1.3.1 油酸脱饱和酶基因  13-14
      1.3.2 抗虫基因  14
      1.3.3 抗病基因  14-15
      1.3.4 雄性不育基因  15
    1.4 油菜选择标记基因  15-17
      1.4.1 抗抗生素基因  15-16
      1.4.2 抗除草剂基因  16
      1.4.3 绿色荧光蛋白  16-17
  2.转基因作物与环境安全性  17-19
    2.1 国内外转基因作物现状  17
    2.2 转基因作物环境安全性问题  17-19
      2.2.1 "杂草化"问题  18
      2.2.2 影响生物多样性  18-19
      2.2.3 花粉飘逸问题  19
  3. 位点特异性重组酶系统  19-22
    3.1 Cre/lox重组系统  19-20
    3.2 R/RS重组系统  20
    3.3 FLP/FRT重组系统  20-21
    3.4 Lox/FRT重组系统  21-22
  4.本文研究的目的及意义  22-23
第二部分农杆菌介导法遗传转化油菜及转基因植株外源基因清除效率分析  23-44
  前言  23-24
  1.材料方法  24-33
    1.1 实验材料  24
      1.1.1 下胚轴  24
      1.1.2 花柄  24
    1.2 主要试剂及配方  24-27
    1.3 菌株与质粒  27-29
      1.3.1 感受态细胞的制备  28
      1.3.2 感受态细胞的转化  28
      1.3.3 重组质粒PCR验证  28-29
    1.4 花粉生活力检测  29
    1.5 花粉GUS组织化学检测  29
    1.6 转基因植株花粉外源基因清除效率检测  29
    1.7 遗传转化方法  29-30
    1.8 再生植株检测  30-33
      1.8.1 GUS组织化学染色  30
      1.8.2 CTAB法小量提取油菜基因组DNA  30
      1.8.3 PCR分子检测  30-31
      1.8.4 Southern印迹杂交  31-33
        1.8.4.1 油菜基因组DNA提取、酶切及电泳  31
        1.8.4.2 地高辛标记探针的制备  31-32
        1.8.4.3 Southern印迹  32
        1.8.4.4 预杂交和杂交  32
        1.8.4.5 洗膜  32
        1.8.4.6 检测杂交信号  32-33
  2.结果分析  33-40
    2.1 重组质粒PCR验证  33
    2.2 转基因植株的获得  33-37
      2.2.1 再生植株的抗性筛选  33-35
      2.2.2 GUS组织化学检测  35-36
      2.2.3 PCR分子鉴定  36
      2.2.4 Southern印迹杂交检测  36-37
    2.3 转基因油菜植株移栽及性状观察  37-38
    2.4 花粉生活力检测  38-39
    2.5 花粉GUS组织化学检测  39
    2.6 转基因植株花粉外源基因清除效率分析  39-40
  3.讨论  40-43
  4.展望  43-44
参考文献  44-51
缩略词  51-52
致谢  52-53
附录  53-55

外源基因清除技术（Gene-deletor）在转基因油菜中的应用研究

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