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农杆菌介导的抗草甘膦玉米的遗传转化

作　者: 马云霞
导　师: 白建荣；王秀红
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: HiII幼胚 农杆菌介导 抗草甘膦基因(sxglr-11) 遗传转化
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


玉米（Zea mays L.）属单子叶植物纲、禾本目、禾本科、玉米属,是重要的粮食、饲料作物,也是食品、医药、化工的重要原料,玉米的产量直接影响着各行业原料的供应。目前,杂草危害是造成玉米减产的重要因素之一,化学除草剂在有效控制杂草的同时也影响玉米的生长,利用基因工程培育抗草甘膦的转基因玉米是解决杂草危害的有效途径。本研究以优良再生体系HiII为研究材料,利用根瘤农杆菌介导法进行玉米抗草甘膦基因（sxglr-11）的遗传转化,并对HiII高效遗传再生体系进行优化,获得了转抗草甘膦基因（sxglr-11）的转基因玉米,为筛选抗草甘膦玉米新种质,选育高抗的草甘膦玉米品种奠定基础。研究内容及结果如下:1.本研究就幼胚大小、硝酸银、嘧啶醇及头孢霉素浓度对遗传再生体系的影响进行了优化。结果表明,1.0-1.5mm长度的幼胚愈伤诱导率和草甘膦抗性筛选率最高;诱导培养基中添加200mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。2.利用根瘤农杆菌介导法将抗草甘膦基因（sxglr-11）转化玉米优良再生体系HiII幼胚,共处理1673个幼胚,诱导愈伤率达88.16%;经含0.002mol/L草甘膦培养上筛选获得715个抗性愈伤,抗性筛选率为67.07%;分化出156株再生苗,67株移入生根培养基,其中28株移栽成活。3.通过对移栽成活的28株再生苗PCR检测,结果13株扩增出1.2kb的特异性条带,表明抗草甘膦基因（sxglr-11）已整合进基因组DNA,阳性率为46.4%。采用Trizol法提取13株转基因植株的总RNA进一步RT-PCR检测,结果11株扩增出1.2kb的特异性条带,表明这11株转基因植株抗草甘膦基因（sxglr-11）得到有效转录。4.通过对未转基因植株5-6叶龄进行4个草甘膦浓度（0.2%、0.4%、1%、2%）涂抹试验,结果得出1%-2%的草甘膦浓度均可作为未转基因植株的致死浓度,将2%的草甘膦浓度作为转基因植株草甘膦抗性筛选浓度,能够更高效的筛选转基因植株。5.利用2%的草甘膦对T0代转基因植株6-8叶龄苗的叶片进行涂抹,结果表明PCR检测为阳性的植株均表现出草甘膦抗性。成活的13株转基因植株中,5株收获果穗,共278粒玉米籽粒。6.T1代植株经2%草甘膦抗性筛选,结果存活的抗性苗和死亡的敏感苗在P=0.05水平上符合3:1的孟德尔分离比,表明抗草甘膦基因（sxglr-11）从T0代稳定遗传到T1代。选用2%、4%和6%的草甘膦浓度涂抹5-6叶龄的T2代转基因植株,结果表明转基因植株的耐受度介于4%-6%之间,与对照植株致死浓度相比,转基因植株抗性有显著提高。

全文目录


中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一章 文献综述  13-26
  1 玉米抗除草剂基因工程的进展  13-16
    1.1 玉米  13
    1.2 玉米抗除草剂基因工程的提出  13
    1.3 国内外抗除草剂转基因玉米的研究情况  13-15
    1.4 抗除草剂转基因玉米的种植情况  15-16
  2 玉米遗传转化方法  16-20
    2.1 农杆菌介导法  17
    2.2 基因枪法  17-18
    2.3 聚乙二醇法  18
    2.4 脂质体法  18-19
    2.5 电穿孔法  19
    2.6 花粉管通道法  19
    2.7 其它方法  19-20
  3 抗除草剂基因的研究进展  20-24
    3.1 六大类抗除草剂基因  20-21
    3.2 抗草甘膦基因  21-24
  4 本研究的目的和意义  24-26
第二章 材料与方法  26-33
  1 材料  26-27
    1.1 供试材料  26
    1.2 主要仪器  26-27
    1.3 试剂及培养基  27
  2 方法  27-33
    2.1 根瘤农杆菌的培养  27
    2.2 转化步骤  27-29
    2.3 玉米遗传转化体系的优化  29
    2.4 PCR检测  29-30
    2.5 RT-PCR检测  30-32
    2.6 草甘膦筛选浓度的确定  32
    2.7 T_0代和T_1代转基因植株的草甘膦抗性分析  32
    2.8 转基因植株草甘膦耐受度的确定  32-33
第三章 结果与分析  33-42
  1 玉米遗传转化体系的优化  33-36
    1.1 幼胚长度对愈伤诱导及抗性筛选的影响  33
    1.2 头孢噻肟钠(Cef.)添加浓度的确定  33-34
    1.3 硝酸银(AgNO_3)对愈伤组织诱导和胚性愈伤形成的影响  34-35
    1.4 嘧啶醇(Ancymidol)在分化培养基中浓度的确定  35-36
  2 玉米幼胚组织培养及植株再生  36-38
  3 转基因植株分子水平的检测  38-39
    3.1 PCR检测  38
    3.2 RT-PCR分析  38-39
  4.T_0及T_1植株草甘膦筛选情况  39-42
    4.1 草甘膦筛选浓度的确定  39-40
    4.2 T_0代再生植株的草甘膦抗性分析  40
    4.3 T_0代结实情况  40
    4.4 T_1代转基因植株的抗草甘膦筛选分析  40-41
    4.5 转基因植株草甘膦耐受度的确定  41-42
第四章 讨论  42-45
  1 受体材料对玉米遗传转化效率的影响  42
  2 培养基中添加剂对组织培养的影响  42-43
    2.1 AgNO_3  42
    2.2 抑菌剂  42-43
    2.3 其它添加剂  43
  3 再生苗移栽  43
  4 RT-PCR  43-44
  5 草甘膦筛选浓度的确定  44-45
参考文献  45-51
附录  51-52
致谢  52-53

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米（玉蜀黍）
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