学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

基于芯片表达干旱响应差异基因的克隆和功能初步鉴定

作　者: 席杰君
导　师: 李汉霞
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄(Solanum lycopersicum) SpPRPP基因 SpPRP基因 SpCTF2A基因基因克隆遗传转化表达模式抗旱性
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 42次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子,也是制约我国农业发展的主要因素之一,据统计干旱给农业生产造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。通过分子育种提高作物耐旱性获得抗旱材料是当前人类面临的重大课题。番茄（Solanum lycopersicum）是一种世界种植的蔬菜,培育抗旱番茄品种具有重要意义。同时,番茄又是一种模式植物,基础研究比较深入,遗传转化体系已经成熟,便于进行基因功能的验证。本实验室利用抗旱性野生番茄品种S.pennellii创制的渐渗系群体中筛选出的耐旱系及其干旱敏感的受体品种M82为材料,与番茄Oligo cDNA芯片杂交,获得大量干旱响应上调和下调表达基因。本研究利用芯片从中筛选出干旱胁迫前后表达量差异较大的基因作为候选基因,构建超量表达载体,并通过遗传转化将目的基因导入双子叶植物中,获得转基因植株,应用不同浓度的PEG进行模拟干旱处理,对基因功能进行初步验证,为下一步系统分析基因的生物学功能及其作用的分子机理奠定了基础。本研究获得的主要结果有:1.芯片结果显示,在干旱胁迫处理后,SpPRP基因、SpPRPP基因和SpCTF2A基因的表达量分别增加了11.1倍、22.6倍和18.1倍。本研究选取SpPRP基因和SpPRPP基因这两个基因作为候选基因,通过芯片结果得到候选基因的EST序列,应用生物信息学分析,得到全长cDNA序列,设计引物,克隆得到两个候选基因的全长cDNA。测序结果表明SpPRPP基因全长789bp,完整的读码框共编码261个氨基酸;SpPRP基因全长981bp,完整的读码框共编码325个氨基酸。通过氨基酸比对结果表明,这两个基因与其他植物的同类基因也具有较高的同源性。2.提取S.pennellii和M82不同组织部位的RNA,半定量RT-PCR,分析发现3个基因在S.pennellii和M82中都具有明显的组织表达特异性。SpCTF2A基因在S.pennellii和M82的不同组织部位均有表达,其中在S.pennellii的茎叶花中表达量较高,在M82的茎花果中表达量较高。SpPRP基因在M82的根和花中表达量较高,SpPRPP基因在M82的茎和花中表达量较高,SpPRP和SpPRPP基因在S.pennellii的叶花中表达量较高,且这两个基因在花中的表达量均最高。3.提取M82在盐、高温和冷胁迫不同逆境处理以及Ethy,SA,ABA和JA不同激素处理下的RNA,半定量RT-PCR分析。发现基因SpCTF2A在三种胁迫处理下表达量与对照相比均有明显增加,且对SA、JA和ABA处理均发生响应,但是在Ethy处理下表达量没有明显变化;SpPRPP基因在盐处理和冷处理下表达量增加,在高温处理下表达量有少量降低,在激素处理下只在ABA和SA诱导下表达量显著升高;SpPRP基因在三种逆境胁迫下表达量都明显上升,在激素处理下对Ethy和SA发生快速响应。4.分别构建了SpPRP基因和SpPRP基因的超量表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法将SpPRP基因、SpPRPP基因和SpCTF2A基因的超量表达载体成功导入番茄品种ZS5、AC和M82,及烟草（Nicotiana tabacum）品种K326中。5.番茄遗传转化共获得卡那霉素抗性植株84株,其中转SpPRP基因共19株,转SpPRPP基因共35株,转SpCTF2A基因共30株;烟草卡那霉素抗性植株50株,其中转SpPRP基因共有15株,转SpCTF2A基因共35株。PCR检测结果初步表明,外源基因已整合到番茄基因组中。6.利用8%的PEG₆₀₀₀对转基因番茄进行模拟干旱处理,结果表明转基因番茄植株与非转基因对照相比,相对含水量增加,大气保水力增强,叶片游离脯氨酸含量也显著性的提高。7.利用20%的PEG₆₀₀₀对转基因烟草进行模拟干旱处理,结果表明转基因烟草与对照相比,在胁迫处理后叶片伤害率明显较小,相对含水量显著较高。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-13
1 课题的提出  13-21
  1.1 干旱胁迫对植物的影响  13-15
    1.1.1 干旱与生长发育  13
    1.1.2 干旱与细胞膜  13-14
    1.1.3 干旱与细胞壁  14
    1.1.4 干旱与光合作用  14
    1.1.5 干旱与呼吸作用  14-15
  1.2 植物在非生物胁迫下的信号传导  15
  1.3 植物在干旱胁迫下诱导表达的基因及蛋白  15-16
    1.3.1 干旱胁迫下功能蛋白基因及编码产物  15
    1.3.2 干旱胁迫下调节基因及编码产物  15-16
  1.4 植物基因工程培育抗旱品种的策略  16
    1.4.1 渗透调节物质合成酶基因  16
    1.4.2 活性氧自由基清除相关基因  16
    1.4.3 胁迫诱导的蛋白基因  16
  1.5 PRP基因的研究现状  16-19
    1.5.1 PRP结构  16-17
    1.5.2 PRP基因功能  17
    1.5.3 PRP基因的表达特征  17-19
  1.6 单加氧酶基因研究进展  19-20
    1.6.1 单加氧酶结构特点  19-20
    1.6.2 植物单加氧酶的表达  20
    1.6.3 植物单加氧酶的功能  20
  1.7 本研究的目的和意义  20-21
  1.8 本研究的技术路线  21
2 材料和方法  21-31
  2.1 植物材料  21
  2.2 菌株、质粒及主要载体  21-22
  2.3 常用培养基  22-23
    2.3.1 LB液体培养基  22
    2.3.2 LB固体培养基  22
    2.3.3 烟草遗传转化培养基  22
    2.3.4 番茄遗传转化培养基  22-23
  2.4 实验方法  23-31
    2.4.1 引物设计  23
    2.4.2 基因克隆特异引物  23
    2.4.3 其他引物  23
    2.4.4 RT-PCR  23-24
    2.4.5 目的基因的扩增  24
      2.4.5.1 SpPRPP基因的获得  24
      2.4.5.2 SpPRP基因的获得  24
    2.4.6 PCR产物的回收和纯化  24-25
    2.4.7 TA克隆  25-26
      2.4.7.1 纯化产物与pMD18-T Vector的重组连接  25
      2.4.7.2 重组体的转化与筛选  25-26
      2.4.7.3 重组质粒的转化鉴定与测序分析  26
    2.4.8 植物表达载体的构建  26-28
      2.4.8.1 Sal I和Kpn I双酶切目的片段  26-27
      2.4.8.2 Kpn I和Xho I双酶切载体pMV  27
      2.4.8.3 回收目的片段和载体片段,连接  27-28
    2.4.9 番茄的遗传转化  28-29
    2.4.10 烟草的遗传转化  29
    2.4.11 组织表达分析  29
    2.4.12 不同逆境胁迫下基因的表达模式  29-30
    2.4.13 转基因植株的PCR阳性检测  30
    2.4.14 转基因番茄植株抗旱性初步分析  30-31
      2.4.14.1 转基因番茄在20%PEG处理下脯氨酸含量的测定  30
      2.4.14.2 转基因番茄在20%PEG处理下叶片细胞膜伤害率的测定  30-31
      2.4.14.3 转基因番茄T0植株大气保水力的测定  31
    2.4.15 转基因烟草抗旱性初步分析  31
      2.4.15.1 转基因烟草相对含水量的测定  31
      2.4.15.2 转基因烟草叶片伤害率的测定  31
3 结果与分析  31-51
  3.1 SpPRPP、SpPRP的克隆与分析  31-39
    3.1.1 番茄叶片总RNA的提取及反转录  31-32
    3.1.2 SpPRP和SpPRPP基因cDNA的克隆  32-35
    3.1.3 SpPRP和SpPRPP基因超量表达载体的构建  35-37
    3.1.4 SpPRP和SpPRPP氨基酸序列同源性比较及多序列比对  37-39
  3.2 转基因植株的获得  39-41
    3.2.1 番茄转基因植株的获得  39-40
    3.2.2 烟草转基因植株的获得  40-41
  3.3 转基因植株的PCR阳性检测  41-44
  3.4 目的基因组织表达分析  44-45
  3.5 目的基因在不同激素诱导和逆境胁迫下的表达  45-46
  3.6 转SpCTF2A基因烟草在20%PEG胁迫处理下的变化  46-48
    3.6.1 20%PEG处理后转基因烟草和对照叶片相对含水量  47
    3.6.2 20%PEG处理后转基因烟草和对照相同部位叶片伤害率  47-48
  3.7 8%PEG胁迫处理后转基因ZS5游离脯氨酸含量  48-50
  3.8 AC和M82转SpPRPP、SpCTF2A和SpPRP基因叶片保水力的测定  50-51
4 讨论  51-54
  4.1 采用芯片杂交法分离和克隆基因  51-52
  4.2 不同番茄品种的遗传转化  52-53
  4.3 SpPRPP基因和SpPRPP基因的功能分析  53
  4.4 外源基因的表达调控  53-54
5 后期工作展望  54-55
参考文献  55-61
致谢  61-62
附录  62-66
  附录一:植物DNA的小量法提取程序  62-63
  附录二:TriZOL一步法提取植物总RNA方法  63-64
  附录三:质粒的小量提取方法  64-65
  附录四:大肠杆菌热击感受态的制备  65-66
  附录五:农杆菌感受态细胞的制备  66

基于芯片表达干旱响应差异基因的克隆和功能初步鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文