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三角帆蚌细胞色素P450基因的克隆与表达

作　者: 郭小泽
导　师: 肖调义
学　校: 湖南农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 三角帆蚌细胞色素P450 克隆表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

细胞色素P450 (CytochromeP450,CYP450)单加氧是一种广泛分布于生物有机体中的重要酶系,它能够代谢多种内源性物质和外源性物质,因其生物学的重要性,一直是生物学研究领域中的重要对象。本文根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,分别用5’-RACE和3’-RACE的方法获得三角帆蚌细胞色素P450基因的全长cDNA。采用生物信息学方法分析了三角帆蚌细胞色素P450基因cDNA序列的结构组成特点。结果表明,所获得的CYP450基因cDNA全长为1978bp,包含5’端非编码区194bp,3’端非编码区222bp,开放阅读框1533bp,可编码510个氨基酸。RT-PCR半定量分析表明,CYP450基因在三角帆蚌的肝脏、胃和肠中有较高的表达,在外套膜中表达最少。将三角帆蚌CYP450完整开放阅读框克隆到原核融合表达载体pET-32a(+)上,测序鉴定后, IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示重组融合蛋白在分子量约58 kDa左右处有明显表达带,与预期分子量大小一致。这一结果为进一步研究CYP450基因在三角帆蚌机体内的功能研究奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-10
第一章细胞色素P450(CYP450)研究进展  10-20
  1 细胞色素P450概述  10-20
    1.1 细胞色素P450发现和研究简史  10-11
    1.2 细胞色素P450的系统命名  11
    1.3 细胞色素P450分布  11-12
    1.4 细胞色素P450结构与P450酶系特征  12-14
      1.4.1 细胞色素P450结构  12-13
      1.4.2 细胞色素P450酶系特征  13-14
    1.5 细胞色素P450作用机理  14-15
    1.6 CYP450的诱导和抑制  15
      1.6.1 诱导  15
      1.6.2 抑制  15
    1.7 细胞色素P450的生物学功能  15-16
      1.7.1 参与物质代谢  15
      1.7.2 解毒功能  15-16
      1.7.3 酶促功能  16
      1.7.4 参与免疫  16
    1.8 CYP450在不同领域的应用研究进展  16-19
      1.8.1 CYP450在医药学方面的研究  16-17
      1.8.2 CYP450在环境保护方面的应用  17-18
      1.8.3 CYP450作为生物学指标评价毒物毒性  18
      1.8.4 CYP450与昆虫的抗性  18-19
      1.8.5 CYP450在软体动物上的研究  19
    1.9 本研究的目的和意义  19-20
第二章三角帆蚌CYP450基因cDNA全长克隆、组织表达及序列分析  20-46
  1 材料和方法  20-29
    1.1 材料  20-21
      1.1.1 实验动物  20
      1.1.2 药品与试剂  20
      1.1.3 质粒和菌株  20
      1.1.4 主要仪器设备  20-21
      1.1.5 实验引物  21
    1.2 实验方法  21-29
      1.2.1 动物材料处理  21-22
      1.2.2 总RNA的提取  22
      1.2.3 mRNA的分离纯化  22-23
      1.2.4 SMART cDNA的合成  23-25
      1.2.5 三角帆蚌CYP450cDNA片段的获得  25-26
      1.2.6 PCR产物的鉴定和胶回收  26
      1.2.7 感受态细胞的制备  26-27
      1.2.8 目的片断的连接和转化  27
      1.2.9 序列分析  27-28
      1.2.10 系统发育树的构建  28
      1.2.11 CYP450基因的RT-PCR分析  28-29
  2 结果与分析  29-43
    2.1 三角帆蚌肝脏总RNA的提取  29
    2.2 三角帆蚌CYP450基因cDNA全长序列拼接及序列分析  29-42
      2.2.1 三角帆蚌CYP450基因cDNA全长的获得  29-33
      2.2.2 CYP450基因编码氨基酸序列结构分析及信号肽预测  33-34
      2.2.3 三角帆蚌CYP450氨基酸序列的跨膜结构、二级结构和三级结构预测  34-36
      2.2.4 三角帆蚌CYP450氨基酸序列与其他物种的同源性比较  36-40
      2.2.5 系统发育分析  40-42
    2.3 三角帆蚌CYP450基因的组织差异表达分析  42-43
  3 讨论  43-46
    3.1 RACE扩增三角帆蚌CYP450全长cDNA序列  43
    3.2 三角帆蚌CYP450基因cDNA序列的基本特征  43-44
    3.3 三角帆蚌CYP450基因在不同组织中的表达  44-46
第三章三角帆蚌CYP450基因的原核表达  46-56
  1 材料与方法  46-51
    1.1 材料  46-47
      1.1.1 主要仪器设备  46
      1.1.2 菌种及载体  46
      1.1.3 酶制剂及化学试剂  46-47
    1.2 实验方法  47-51
      1.2.1 原核表达载体的构建及质粒重组  47-50
      1.2.2 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE鉴定  50-51
  2 实验结果  51-54
    2.1 三角帆蚌CYP450基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)扩增  51
    2.2 三角帆蚌CYP450基因重组表达质粒构建和鉴定  51-52
    2.3 三角帆蚌CYP450基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)片段测序鉴定  52-53
    2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测  53-54
  3 讨论  54-56
    3.1 表达载体的选择、诱导条件及重组蛋白的表达形式  54
    3.2 三角帆蚌CYP450原核表达载体构建及融合蛋白表达  54-55
    3.3 三角帆蚌CYP450原核表达研究展望  55-56
结论  56-57
参考文献  57-63
附录  63-69
致谢  69-70
作者简介  70

三角帆蚌细胞色素P450基因的克隆与表达

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