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沙丁胺醇兔单克隆抗体的制备及ELISA快速检测试剂盒的研制

作　者: 王艺熹
导　师: 郑晓冬
学　校: 浙江大学
专　业: 食品安全
关键词: 沙丁胺醇 β-兴奋剂 人工抗原 兔单克隆抗体 重组抗体 酶联免疫吸附试验
分类号: TQ421.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


沙丁胺醇（Salbutamol,Sal）是人工合成的水杨醇类β-肾上腺素激动剂,化学名为1-（4-羟基-3羟甲基苯基）-2-（叔丁胺基）乙醇硫酸盐,是一种选择性β2-受体激动剂。临床上Sal主要用于支气管哮喘的治疗。近年来,因发现Sal具有促进肌肉沉积的作用,可用作牛、羊、禽、猫等畜禽的促生长剂。Sal促生长作用与克伦特罗（Clenbuterol,Clb）类似,而且体内代谢时间又较Clb短暂、毒副作用也相对较弱,因此,目前Sal已成为继Clb之后营养重分配剂的首选药物。但Sal在食品动物中的残留会导致严重的食品安全性问题,我国农业部明文规定禁止将Sal在动物食品中使用,然而受经济利益的驱使,Sal非法使用事件时有发生。因此,建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便、适用于大批量样品筛选的Sal检测方法是一项非常紧迫的任务。本研究对Sal人工抗原的合成、动物免疫、Sal兔单抗制备及ELISA检测方法建立等进行了研究,主要结果如下:1、本试验首先将Sal小分子改造成琥珀酸衍生物（Sal-HS）,然后采用混合酸酐法成功合成了两种人工抗原:免疫抗原Sal-BSA和包被抗原Sal-OVA。通过SDS-PAGE电泳证实Sal与BSA、OVA成功偶联,经考马斯亮蓝法测得Sal-BSA的蛋白质浓度为0.7mg/ml。2、将合成成功的Sal-BSA人工抗原免疫4只健康的NZW兔子,2个半月后获得相应的高效价多抗血清。根据ELISA试验结果,最后筛选出A1091编号的兔子血清作为后续试验备用。3、取得兔子脾脏后,采用台盼蓝染色计数法测得脾细胞存活率为96.3%,将脾细胞与处于对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E进行细胞融合,其融合率为60%～65%。细胞融合后三周,用间接ELISA法检测40块96孔细胞培养板中的上清,共获得56个阳性克隆孔,将克隆转移至24孔细胞培养板中进行培养。4、一周后,用间接ELISA测56个克隆的细胞培养上清,共获得阳性孔43个,其中双阳性孔31个。综合比较间接ELISA、IgG定量的结果及细胞生长状态,选择Huam-003-6、Huam-003-11、Huam-003-16、Huam-003-22、Huam-003-29五个多克隆进入亚克隆,同时选择Huam-003-18、Huam-003-23、Huam-003-24、Huam-003-35、Huam-003-42多克隆进行冻存处理。5、将亚克隆的阳性孔转移至24孔板培养,共获得经过克隆化的细胞株8株,采用间接ELISA、间接竞争ELISA法筛选,最终筛选出Huam-6-1、Huam-6-4、Huam-6-8、Huam-11.3、Huam-11-8、Huam-16-3、Huam-16-8共7株高特异性的杂交瘤细胞进行冻存,并选取Huam-11-8进行生产。6、从Huam-11-8杂交瘤细胞分离mRNA,分别克隆其重链和轻链基因,基因经酶切后与质粒连接,涂板挑取克隆,大肠杆菌过夜培养提取质粒,重链轻链质粒配对转染至293T细胞进行表达,无菌收集细胞,离心后取培养上清。本试验分两次转染,第一次小量转染后获得了6株Sal单抗质粒。通过间接ELISA试验和间接竞争ELISA试验确定进入第二次大规模转染的Sal单抗质粒为Huam003-11-8-H2/L2。7、通过重组抗体技术生产Sal单抗,采用ProteinA纯化方法纯化并收集Sal单抗,共得到9mlSal单抗。8、对重组兔Sal单抗ELISA检测条件进行了优化,确定以下条件为ELISA最佳条件:Sal-OVA经500倍稀释,37℃包被2h;选择0.5%明胶作为封闭液,37℃封闭2.5h;一抗的工作效价为20000倍,最佳反应条件为37℃,60min;二抗经5000倍稀释后的最佳反应条件为37℃,80min;对底物配方进行优化,得到TMB和H2O2的最佳组合为0.275mg/ml的TMB+0.015%的H2O2,显色条件为37℃,10min。9、采用间接竞争ELISA法测定Sal单抗的亲和性,结果显示Sal单抗的IC50浓度为9.01ng/ml,IC10浓度为0.81ng/ml,说明本试验制备得到的Sal单抗具有良好的亲和性。10、采用间接竞争ELISA法测定Sal单抗的特异性。从β-兴奋剂、抗生素、喹诺酮类药物、磺胺类药物、激素、农药等不同种类药物中选取了15种小分子进行交叉反应性测定。结果显示,本试验制得的Sal单抗除了与Clb具有22.47%的交叉反应性以外,与其余物质均没有交叉反应性,说明本试验制备的Sal单抗特异性较理想。11、对ELISA法测定样品的准确度进行试验,结果表明不同浓度的尿样及猪肉样品检测的回收率总体在75%～120%之间;本实验中不同添加浓度的样品变异系数大都在10%以下,说明采用本ELISA检测试剂盒测定尿样和猪肉样品具有较好的准确性。12、本试验采用间接竞争ELISA法分别在PBS缓冲液背景、5倍稀释尿样背景及5倍稀释猪肉样品背景中测得3条标准曲线,分别为:y=38.249x+13.484（R2=0.990,IC10=0.81 ng/mL,IC50=9.01ng/ml,线性区间为0.5～100ng/ml）;y=36.599x+3.970（R2=0.982,IC10=1.46ng/mL,IC50=18.10ng/ml,线性区间为1～100ng/ml）;y=45.371x+2.127（R2=0.992,IC10=1.49ng/mL,IC50=11.35ng/ml,线性区间为1～50ng/ml）;其中x为Sal浓度（ng/ml）对数,y为抑制率。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-11
目录  11-13
英文缩写语表  13-14
1 文献综述  14-38
  1.1 β2-肾上腺素受体激动剂概述  14-17
    1.1.1 β2-肾上腺素受体激动剂基本结构与分类  14-17
    1.1.2 沙丁胺醇理化性质  17
  1.2 β2-肾上腺素受体激动剂的作用机理  17-21
    1.2.1 β2-肾上腺素受体激动剂与动物促生长作用  18-19
    1.2.2 β2-肾上腺素受体激动剂对脂肪组织的作用  19-21
    1.2.3 β2-肾上腺素受体激动剂对激素的调节作用  21
    1.2.4 β2-肾上腺素受体激动剂对蛋白质的调节作用  21
  1.3 β2-肾上腺素受体激动剂在机体内的吸收、代谢及残留分布  21-23
    1.3.1 β2-肾上腺素受体激动剂在机体内的吸收  21-22
    1.3.2 β2-肾上腺素受体激动剂在机体内的代谢  22
    1.3.3 β2-肾上腺素受体激动剂在机体内的残留分布  22-23
  1.4 β2-兴奋剂残留对机体的毒性作用  23-25
    1.4.1 β2-兴奋剂的急慢性毒性  23
    1.4.2 近几年国内外β2-兴奋剂的中毒事件  23-25
  1.5 沙丁胺醇检测的国内外标准  25-26
  1.6 沙丁胺醇检测技术的研究进展  26-36
    1.6.1 理化检测法  26-29
    1.6.2 免疫分析法  29-34
    1.6.3 受体分析法  34-35
    1.6.4 检测方法小结  35-36
  1.7 本研究的意义和目的  36-38
2 材料与方法  38-58
  2.1 试验材料  38-41
    2.1.1 主要试剂  38-40
    2.1.2 主要设备  40-41
    2.1.3 试验动物  41
    2.1.4 其他材料  41
  2.2 试验方法  41-58
    2.2.1 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定  41-44
    2.2.2 免疫兔子获得多抗血清  44-45
    2.2.3 兔单克隆抗体的制备  45-49
    2.2.4 沙丁胺醇ELISA检测方法的初步建立  49-55
    2.2.5 沙丁胺醇ELISA检测试剂盒的组装与样品的检测  55-58
3 试验结果与分析  58-82
  3.1 沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定  58-60
    3.1.1 沙丁胺醇免疫抗原的鉴定  58-59
    3.1.2 考马斯亮蓝法测定沙丁胺醇免疫抗原浓度  59-60
  3.3 兔单克隆抗体的制备  60-65
    3.3.1 杂交瘤细胞的筛选与克隆  60-63
    3.3.2 采用重组抗体技术生产沙丁胺醇单克隆抗体  63-65
  3.4 沙丁胺醇ELISA检测方法的初步建立  65-77
    3.4.1 包被条件的确定  65-67
    3.4.2 封闭条件的优化  67-69
    3.4.3 一抗作用时间的确定  69
    3.4.4 酶标二抗作用时间的确定  69-70
    3.4.5 底物条件的选择  70-74
    3.4.6 沙丁胺醇兔单克隆抗体效价的测定  74
    3.4.7 沙丁胺醇兔单克隆抗体亲和性的测定  74-75
    3.4.9 沙丁胺醇兔单克隆抗体特异性的测定  75-77
  3.5 沙丁胺醇ELISA检测试剂盒的组装与样品的检测  77-82
    3.5.1 沙丁胺醇ELISA检测试剂盒的组装  77-78
    3.5.2 尿样的处理与检测  78-80
    3.5.3 猪肉样品的处理与检测  80-81
    3.5.4 试剂盒准确性试验  81-82
4 结论与展望  82-85
  4.1 本实验得到的主要结论  82-84
  4.2 本研究的创新点  84
  4.3 后续进一步研究的问题与展望  84-85
参考文献  85-94
作者简介  94

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