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L型Ca2+通道在帕金森病黑质多巴胺能神经元损伤中的作用研究

作　者: 王荣
导　师: 谢俊霞
学　校: 青岛大学
专　业: 神经生物学
关键词: 帕金森病 L型Ca2+通道 铁 多巴胺 黑质
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 28次
引　用: 1次
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内容摘要


帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。其主要病理特征为黑质致密带(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的脱失及伴发的纹状体(striatum, Str)轴突末梢多巴胺的耗竭。在PD的发病过程中,DA能神经元的死亡机制尚未完全明了,但已有的研究结果表明：遗传因素,凋亡,线粒体功能障碍,黑质铁含量的增高,氧化应激,感染和兴奋毒在内的多种因素都可能参与这个过程。最新研究表明,L型Cav1.3型Ca2+通道持续开放导致Ca2+大量内流是黑质(substantia nigra, SN) DA能神经元Ca2+超载和神经元选择性变性的重要原因之一。此外,PD的发病过程中铁选择性的聚集在SN区,而过量的铁聚积会引发羟自由基(hydroxyl radical, OH·)的生成,进而损伤蛋白质、核酸和细胞膜,最终导致细胞死亡,但铁选择性聚积在该区的原因尚不清楚。大量的证据表明,在心肌细胞,L型Cav1.2型Ca2+通道介导铁进入细胞,参与铁的转运过程。在神经细胞上,L型Cav1.2型和Cav1.3型Ca2+通道广泛表达,而L型Cav1.2型Ca2+通道是Ca2+内流的主要途径,且L型Cav1.2型Ca2+通道在DA能神经元变性中的作用尚不清楚。为研究L型Ca2+通道在PD发病过程中的作用及可能机制,本实验采用MTT比色法、乳酸脱氢酶检测法、高效液相色谱电化学检测法、分子生物学方法、行为学检测等技术方法探讨L型Ca2+通道在黑质多巴胺能神经元死亡中的作用,并进一步探讨其可能机制。实验结果如下：1.不同浓度的6-OHDA (5-100μmol/L)处理PC12细胞24 h后,细胞存活率均有不同程度的下降(P<0.01,与对照组相比)；应用Ca2+通道阻断剂硝苯地平(10μmol/L)与6-OHDA (100μmol/L)共处理PC12细胞24 h可以逆转6-OHDA对PC12细胞的损伤作用(P<0.01,与6-OHDA损伤组相比)。2.10μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h后,PC12细胞中L型Cav1.2型Ca2+通道α1亚单位mRNA的表达量显著增高(P<0.01,与对照组相比)。3.6-OHDA单侧损毁大鼠内侧前脑束(MFB) 3d、7d、14d、28d后,大鼠出现由APO诱发的旋转行为(P<0.01,与对照组相比),在14d时,旋转圈数达到最多；应用Ca2+通道阻断剂硝苯地平可以明显改善上述旋转行为(P<0.01,与6-OHDA损毁组相比)。4.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB 3 d后,损毁侧黑质L型Cav1.2型Ca2+通道α1亚单位mRNA的表达量有增高趋势,但无统计学意义(P>0.05,与对照组相比)；6-OHDA单侧损毁大鼠MFB 7 d、14 d、28 d后,损毁侧黑质L型Cav1.2型Ca2+通道α1亚单位mRNA的表达量均有显著的增高(P<0.01,与对照组相比)。5.6-OHDA单侧损毁大鼠MFB7d后,损毁侧纹状体DA含量明显降低(P<0.01,与对照组相比),应用Ca2+通道阻断剂硝苯地平可以部分逆转此现象(P<0.05,与6-OHDA损毁组相比)。6.葡聚糖铁制备的急性铁负载组大鼠黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH) mRNA的表达量明显减少(P<0.01,与对照组相比)；硝苯地平预处理可抑制急性铁负载组大鼠黑质TH mRNA表达的下调(P<0.01,与急性铁负载组相比)。7.葡聚糖铁制备的急性铁负载组大鼠黑质铁含量显著升高(P<0.01,与对照组相比)；硝苯地平预处理后大鼠黑质铁含量较急性铁负载组明显减少(P<0.01,与急性铁负载组相比)。上述结果表明：L型Cav1.2型Ca2+通道α1亚单位在6-OHDA损毁的大鼠PD模型以及6-OHDA处理的PC12细胞中表达量均有增加；Ca2+通道阻断剂硝苯地平可以部分逆转6-OHDA导致的PC12细胞的死亡、大鼠损毁侧纹状体DA含量的降低以及APO诱导的大鼠旋转行为；硝苯地平还可以逆转急性铁损伤大鼠黑质TH mRNA表达量的减少和铁含量的增多,表明L型Ca2+通道参与PD的发病过程,可能是导致黑质铁聚积和多巴胺能神经元变性死亡的一个因素。本结果为Ca2+通道参与PD发病机理的研究提供了新的资料,并为PD的药物治疗提供新的思路。

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-9
引言  9-11
材料和方法  11-24
  1. 细胞培养  11-12
  2. MTT方法检测细胞存活率  12-13
  3. 乳酸脱氢酶(LDH)的释放检测细胞损伤程度  13-14
  4. 逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)检测PC12细胞L型Cav1.2型Ca~(2+)通道α1亚单位mRNA水平  14-17
  5. 动物行为学测定  17-18
  6. 纹状体内多巴胺及其代谢产物含量的测定(HPLC法)  18-20
  7. 大鼠黑质区L型Cav1.2型Ca~(2+)通道α1亚单位mRNA水平的检测  20
  8. 葡聚糖铁铁负载大鼠黑质区TH mRNA水平的检测  20-22
  9. 葡聚糖铁铁负载大鼠黑质内铁含量的测定  22-23
  10. 统计学处理  23-24
结果  24-30
  1. 硝苯地平部分逆转6-OHDA对PC12细胞的毒性作用  24-25
  2. 6-OHDA处理后PC12细胞L型Cav1.2型Ca~(2+)通道α1亚单位mRNA表达上调  25-26
  3. 硝苯地平可以改善6-OHDA单侧损毁MFB的大鼠由APO诱发的旋转行为  26
  4. 6-OHDA单侧损毁MFB的大鼠黑质L型Cav1.2型Ca~(2+)通道α1亚单位mRNA表达的变化  26-27
  5. 硝苯地平可以部分逆转6-OHDA单侧损毁MFB的大鼠纹状体DA含量的降低  27-28
  6. 硝苯地平对急性铁负载模型大鼠黑质TH mRNA表达量的影响  28-29
  7. 硝苯地平对急性铁负载模型大鼠黑质铁含量的影响  29-30
讨论  30-33
结论  33-34
参考文献  34-41
综述  41-60
  参考文献  51-60
攻读硕士期间的研究成果  60-61
附录 (缩略词表)  61-63
致谢  63-64

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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