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氨基甾体小分子L1对K562慢粒白血病细胞系的作用和机制

作　者: 李碧蓉
导　师: 何群
学　校: 中南大学
专　业: 生理学
关键词: K562细胞系 氨基甾体 钙通道 分化 增殖 bcr/abl融合基因 白血病
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：观察氨基甾体类化合物L1对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用,并进一步探讨其作用机制。方法：通过液体培养实验、集落培养实验、MTT实验观察氨基甾体类化合物L1对K562细胞的抑制增殖作用；同时对正常人外周血单个核细胞(MNC)进行MTT实验及对正常人外周血(CFU-GM)集落培养实验来观察氨基甾体L1对正常人外周血细胞的作用。采用Wright染色、流式细胞术、联苯胺染色观察K562细胞的功能变化,以评价L1对K562细胞的诱导分化作用。为进一步研究氨基甾体类化合物L1对K562细胞的作用机制,通过荧光分光光度计检测K562细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化,通过荧光定量PCR (RT-PCR)检测K562细胞钙通道TRPV6蛋白mRNA表达的影响,通过RT-PCR实验检测K562细胞内的bcr/abl融合基因：mRNA表达的影响。结果：1、氨基甾体化合物L1对K562细胞增殖的影响。将不同终浓度的L1(10-8-10-4mol/L)作用于K562细胞,连续培养的5d,MTT实验显示氨基甾体化合物L1作用K562细胞的第5d的生长抑制率分别为10-8(34.38±2.69)%；10-7(34.90±2.31)%；10-6(53.91±3.46)%；10-5(51.04±1.83)%；10-4(87.24±6.54)%,L1可以抑制K562细胞的增殖且抑制作用呈浓度依赖关系。将浓度不同氨基甾体L1(10-8-10-4mol/L)加入K562细胞连续培养8d,集落产率分别为10-8(297.3±13.1)；10-7(281.5±17.9)；10-6(225.4±35.9)；10-5(92.7±13.1)；10-4(2.88±4.68),对照组为(349.1±18.8),集落产率显著降低(P<0.01)。同时将氨基甾体化合物L1以10-6mol/L作用于外周血单个核细胞(MNC)连续培养第5d集落产率对照组为(166.3±6.5),实验组为(163.9±15.3),未见明显抑制作用(P>0.05),可见氨基甾体化合物L1的抑制作用具有选择性,主要对K562细胞具有抑制作用并呈浓度依赖性。2.氨基甾体化合物L1对K562细胞分化的影响。K562细胞培养5d后,Wright-Giemsa染色,镜下观察发现K562细胞核浆比例减少、胞质增多、浅染、有核切迹、核染色质浓集变粗,核周胞质出现淡染区呈一定程度的分化。经氨基甾体化合物L1作用K562细胞细胞内血红蛋白联苯胺染色显示,不同终浓度的氨基甾体化合物L1(10-8-10-4mol/L)作用K562细胞第5d,联苯胺染色A值分别为：10-9(0.151±0.024),10-8(0.169±0.024),10-7(0.205±0.045),10-6(0.286±0.106),10-5(0.337±0.027),较对照组(0.085±0.002)显著升高(P<0.01),并表现浓度依赖性。流式细胞仪分析显示,氨基甾体化合物L1以10-6mol/L作用于K562细胞5d后,细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为78%。3.氨基甾体L1对K562细胞内游离[Ca2+]i的影响。用Fura-2/AM负载K562细胞,经终浓度为10-6mol/L的氨基甾体化合物(L1)处理细胞0.5h后,荧光分光光度计检测其荧光强度值对照组为(161.39±6.37),实验组为(133.88±3.55)实验组较对照组显著下降(P<0.01)。4.RT-PCR检测氨基甾体L1作用K562细胞后TRPV6钙通道蛋白mRNA表达量的变化。终浓度106-mol/L的氨基甾体L1作用于K562细胞第5d,提取RNA进行逆转录和扩增,RT-PCR测定K562细胞TRPV6钙通道mRNA相对含量,对照组为(6.01±0.44),实验组为(2.69±0.21),钙通道蛋白mRNA表达显著下调(P<0.01)。5.氨基甾体对K562细胞bcr/abl融合基因的影响：终浓度10-6mol/L的氨基甾体L1作用于K562细胞第5d,提取RNA进行逆转录及扩增,RT-PCR测定K562细胞bcr/abl mRNA相对含量对照组为(6.24±0.15),实验组为(2.75±0.91), bcr/abl融合基因表达显著下调(P<0.01)。结论：1、氨基甾体L1对K562细胞生长具有显著抑制作用,且呈一定剂量依赖关系。对正常人的外周血细胞抑制作用不明显。2、氨基甾体L1能有效诱导K562细胞向红系分化。3、氨基甾体L1作用于K562细胞30min后,使K562细胞内游离[Ca2+]i下降。4、氨基甾体L1可使K562细胞内TRPV6钙通道蛋白基因mRNA表达下调。5、氨基甾体L1可使K562细胞bcr/abl融合基因mRNA的表达下调。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
第一章 前言  13-16
第二章 材料和方法  16-22
  2.1 细胞系  16
  2.2 药物  16
  2.3 材料  16-17
  2.4 实验分组  17
  2.5 检测指标  17-21
  2.6 统计学处理  21-22
第三章 实验结果  22-28
  3.1 白血病细胞的生长状况  22-23
  3.2 氨基甾体化合物对白血病细胞MTT值的影响  23-24
  3.3 氨基甾体对白血病细胞集落产率的影响  24-25
  3.4 氨基甾体L1对K562细胞形态的影响  25
  3.5 氨基甾体L1对K562细胞内血红蛋白(HB)联苯胺染色的影响  25-26
  3.6 氨基甾体L1对K562细胞膜CD71表面标记表达的测定  26
  3.7 机理研究  26-28
第四章 讨论  28-31
第五章 结论  31-32
附图  32-39
综述  39-44
参考文献  44-50
致谢  50-51
攻读硕士期间的主要研究成果  51

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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