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青蒿素类抗疟药大鼠体内自身诱导代谢机理的研究

作　者: 王向
导　师: 张淑秋
学　校: 山西医科大学
专　业: 药剂学
关键词: 青蒿素双氢青蒿素实时荧光定量PCR 酶活性 Western blot 鼠肝微粒体
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：青蒿素类抗疟药是含内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物。近年来研究发现这类药物具有自身诱导代谢现象,且青蒿素类药物在人体内由CYP2B6和CYP3A4介导代谢,并能诱导CYP2C19。而核受体超家族是介导CYP450诱导的关键调控因子,其中主要有孤儿核受体孕烷X受体(PXR)及组成型雄烷受体(CAR)。青蒿素类药物是否通过激活核受体PXR或CAR而导致其对CYP450的诱导,目前尚不清楚。本文选择青蒿素类衍生物的母体化合物青蒿素(ART)及该类衍生物的活性代谢物双氢青蒿素(DHA)作为目标药物,以CYP2B、CYP3A和CYP2C为考察目标,从药物代谢角度,采用分子生物学方法(PCR、Western blot),在体内条件下,探讨了该类药物对CYP450的诱导机制。方法：将SD大鼠随机分成8组(每组6只)。口服ART诱导组：80mg／kg／d；口服DHA诱导组：10mg／kg／d；口服溶剂对照组；静注ART诱导组：16mg/kg/d；静注DHA诱导组：5mg/kg／d;静注溶剂(ART)对照组；静注溶剂(DHA)对照组；空白对照组：不经任何处理。均连续给药5天,末次给药24h后处死大鼠,取出肝脏,用于mRNA、酶活性和蛋白的测定。结果：(1)mRNA的测定：取肝组织,Trizol一步法提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测PXR、CAR、CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6mRNA。2-△△Ct法计算相对定量结果。相比溶剂对照组和空白对照组,口服ART和DHA诱导组大鼠CYP2B1mRNA水平显著增加(P<0.001),口服ART诱导组大鼠CARmRNA水平显著增加(P<0.001),而静注ART和DHA诱导组大鼠核受体及CYP450mRNA水平与对照组间均无显著性差异。(2)酶活性的测定：超速离心法制备肝微粒体,并用紫外分光光度法测定蛋白浓度及CYP450含量。口服ART诱导组CYP450含量为：1.45nmol/mg；口服DHA诱导组CYP450含量为：1.38nmol/mg；口服溶剂对照组CYP450含量为：0.81nmol/mg;空白对照组CYP450含量为：0.79nmol/mg；静注ART诱导组CYP450含量为：0.75nmol/mg；静注溶剂(ART)对照组CYP450含量为：0.78nmol/mg；DHA多剂量静注诱导组CYP450含量为：0.79nmol/mg；静注溶剂(DHA)组CYP450含量为：0.84nmol/mg。相比溶剂对照组和空白组,口服ART和DHA诱导组大鼠CYP450含量均较高。Nash法测定微粒体中CYP3A同工酶催化的红霉素N-去甲基化酶活性。口服ART诱导组单位时间内甲醛生成量为：2.29μmol/mg／min；多剂量DHA口服诱导组单位时间内甲醛生成量为：1.75μmol/mg／min口服溶剂对照组单位时间内甲醛生成量为：0.82μmol/mg／min；空白对照组单位时间内甲醛生成量为：0.75μmol/mg／min；静注ART诱导组单位时间内甲醛生成量为：0.72μmol/mg／min；静注溶剂(ART)对照组单位时间内甲醛生成量为：0.75μmol/mg／min；静注DHA诱导组单位时间内甲醛生成量为：0.79μmol/mg／min；静注溶剂(DHA)对照组单位时间内甲醛生成量为：0.85μmol/mg/min。相比溶剂对照组和空白组,口服ART和DHA诱导组大鼠CYP3A1酶活性较高。荧光分光光度法测定微粒体中CYP2B同工酶活性。口服ART诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：10.30×10-3μmol/mg／min；口服DHA诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：8.19×10-3μmol/mg／min；口服溶剂对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.68×10-3μmol/mg／min；空白对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.41×10-3μmol/mg／min；静注ART诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.24×10-3μmol/mg／min；静注溶剂(ART)对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.26×10-3μmol/mg／min；静注DHA诱导组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.25×10-3μmol/mg／min;静注溶剂(DHA)对照组单位时间内9-羟基-3-异恶唑生成量为：5.74×10-3μmol/mg／min。相比溶剂对照组和空白组,口服ART和DHA诱导组大鼠CYP2B1酶活性较高。高效液相色谱法测定CYP2C6底物双氯芬酸钠经微粒体孵化后剩余量以检测CYP2C6酶活性。口服ART诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：31.20%；口服DHA诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：18.02%；口服溶剂对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.54%；空白对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.37%；静注ART诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：15.59%；静注溶剂(ART)对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.02%；静注DHA诱导组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：16.41%；静注溶剂(DHA)对照组单位时间内双氯芬酸钠代谢率为：17.93%。相比溶剂对照组和空白组,口服ART诱导组大鼠CYP2C6酶活性较高。(3)蛋白的测定：提取肝组织总蛋白,Western blot测定PXR和CAR蛋白,对比对照组,实验组无统计学意义(P>0.05)；制备的肝微粒体,Western blot测定CYP3A1、CYP2B1及CYP2C6蛋白,对比对照组,实验组无明显差别。结论：以上结果表明,多剂量口服青蒿素能上调大鼠CAR受体及CYP2B的mRNA水平；多剂量口服双氢青蒿素能够上调CYP2B mRNA水平。青蒿素类药物很有可能是通过激活核受体CAR而进一步诱导CYP2B表达。另一方面多剂量口服青蒿素和双氢青蒿素均使CYP450酶活性增强,该类药物诱导了CYP450酶活性而加速了自身代谢。而多剂量静注青蒿素和双氢青蒿素对核受体mRNA水平及CYP450s 1nRNA水平和酶活性均没有影响。说明青蒿素类药物对于CYP450的诱导作用基于首过代谢。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
1 前言  10-14
2 材料和方法  14-27
  2.1 实验材料  14-16
    2.1.1 主要仪器  14
    2.1.2 药品与试剂  14-16
    2.1.3 实验动物  16
  2.2 方法  16-27
    2.2.1 动物给药方案  16
    2.2.2 青蒿素类药物对核受体和CYP450s mRNA表达水平的影响  16-19
    2.2.3 青蒿素类药物对CYP450酶活性的影响  19-22
    2.2.4 青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白表达水平的影响  22-27
3 结果  27-45
  3.1 青蒿素类药物对大鼠肝核受体和CYP450s mRNA的影响  27-32
    3.1.1 青蒿素对大鼠肝脏核受体mRNA水平的影响  27-28
    3.1.2 双氢青蒿素对大鼠肝脏核受体mRNA水平的影响  28-29
    3.1.3 青蒿素对大鼠肝脏CYP450s mRNA水平的影响  29-30
    3.1.4 双氢青蒿素对大鼠肝脏CYP450s mRNA水平的影响  30-32
  3.2 青蒿素类药物对CYP450酶活性的影响  32-42
    3.2.1 标准曲线制备  32
    3.2.2 蛋白浓度测定及CYP450含量测定  32-37
    3.2.3 青蒿素类药物对CYP3A1酶活性的影响  37-39
    3.2.4 青蒿素类药物对CYP2B1酶活性的影响  39-40
    3.2.5 青蒿素类药物对CYP2C6酶活性的影响  40-42
  3.3 青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450蛋白的影响  42-45
    3.3.1 青蒿素对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白的影响  42-43
    3.3.2 双氢青蒿素对大鼠肝核受体和CYP450酶蛋白的影响  43-45
4 讨论  45-48
  4.1 青蒿素类药物对大鼠肝内核受体和CYP450s mRNA水平的影响  45-46
  4.2 青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶活性的影响  46-47
  4.3 青蒿素类药物对大鼠肝脏核受体和CYP450酶蛋白的影响  47-48
5 结论  48-49
参考文献  49-53
个人简介  53-54
致谢  54

青蒿素类抗疟药大鼠体内自身诱导代谢机理的研究

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