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小鼠白介素17基因的表达、纯化、活性鉴定及抗小鼠白介素17抗体的制备

作　者: 王金萍
导　师: 邓松华；沈际佳
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: rmIL-17 原核表达 生物学活性 单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的通过基因工程技术获得有活性的重组小鼠白介素17(recombinant mouse Interleukin-17,rmIL-17)蛋白,检测验证rmIL-17的活性及免疫原性。同时用纯化的重组蛋白rmIL-17免疫小鼠及家兔,制备并鉴定抗rmIL-17蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体,为进一步研究IL-17的生物学作用及其作用机制提供基础。方法用RT-PCR技术得到小鼠IL-17编码基因,将其克隆入原核表达载体pET32a,转化至大肠埃希菌(E. coli) BL21株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过亲和层析制备纯化的rmIL-17蛋白,免疫家兔制备抗rmIL-17多克隆抗体并纯化多抗,用多抗做Western-blot和酶联免疫吸附实验鉴定该蛋白免疫原性;用rmIL-17蛋白进行体外小鼠成纤维细胞刺激实验,将小鼠3T3成纤维细胞调整密度为4×105/ml于24孔板中,分别加入rmIL-17蛋白至终浓度0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000ng/ml,放入CO2孵箱中共孵育24小时,取上清,用鼠IL-6定量酶联检测试剂盒ELISA检测IL-6浓度。同样条件下以1000ng/ml日本血吸虫29KD膜外重组蛋白为阴性对照,培养基为空白对照;用rmIL-17蛋白进行体内中性粒细胞招募实验,试验组用无菌的PBS稀释0.5μg rmIL-17蛋白至500μl,BALB/C小鼠腹腔内注射。腹腔注射等量日本血吸虫29KD膜外重组蛋白做对照组。0.5μg rmIL-17和10μg抗鼠IL-17中和抗体用无菌PBS稀释至500μl,37℃孵育15分钟后,腹腔注射,作为中和组。4小时之后分别放血处死小鼠,打开腹腔用2.5ml含有3mM EDTA的PBS冲洗,收集洗出液,进行细胞总数计数和中性粒细胞染色计数;用rmIL-17蛋白免疫小鼠6周后,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行杂交融合,HAT筛选出杂交瘤细胞,经亚克隆及扩大培养,建立抗rmIL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA法检测杂交瘤上清。Western-Blotting实验鉴定单克隆抗体的免疫学特性。结果成功构建了重组质粒pET32a-mIL17并在大肠杆菌中表达。过柱得到纯化的rmIL-17蛋白,制备了抗rmIL-17多克隆抗体Western-blot实验证实其具有良好的免疫原性;体外细胞刺激实验显示该蛋白可刺激小鼠3T3成纤维细胞产生白介素6(Interleukin-6,IL-6)且具有量效关系;随着加入的rmIL-17蛋白浓度的升高,小鼠3T3成纤维细胞分泌IL-6的量也随之升高;体内细胞招募实验显示纯化的rmIL-17蛋白具有招募中性粒细胞的作用。以日本血吸虫29KD膜外重组蛋白为对照组,以抗鼠IL-17中和抗体中和组,对照组(0.481±0.154)×106与实验组(4.27±1.10)×106差异具有显著性(P<0.05) ,中和组(2.01±0.90)×106与实验组(4.27±1.10)×106差异也有显著性(P<0.05),证实了rmIL-17的体外活性;制备两株抗rmIL-17单克隆抗体,单抗亚型分别为IgG1, IgG2a;Western-Blotting结果证实了该2株单克隆抗体的免疫学特性。结论小鼠IL-17基因在体外成功表达,且表达的重组蛋白具有明显的生物学活性。rmIL-17多克隆抗体和单克隆抗体的制备为我们下一步的实验奠定了的基础。

全文目录


中英文词汇对照表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
引言  11-13
材料与方法  13-29
结果  29-37
讨论  37-40
参考文献  40-43
附录一 个人简历  43-44
附录二 致谢  44-45
综述  45-54

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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