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烟酰胺合酶基因的导入对甘蓝型油菜盐碱胁迫的响应

作　者: 毛善婧
导　师: 王幼平
学　校: 扬州大学
专　业: 发育生物学
关键词: 甘蓝型油菜烟酰胺合酶基因农杆菌转基因盐胁迫生理指标
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 62次
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内容摘要

油菜是世界四大油料作物之一,具有适应性强、用途广泛、经济价值高、发展潜力大的特点,因此一直备受众多育种学家的关注。随着世界环境的日益恶化,可利用的土地资源日趋减少,如何有效地对盐碱土进行合理利用已经成为众多国家和地区所密切关注的热点问题。早期使用传统育种手段对油菜进行抗逆良种培育,但周期性较长进展缓慢。随着基因工程和生物技术的发展,通过转基因的方式导入抗逆的目的基因从而改良作物品种,越来越多的受到人们的广泛重视。烟酰胺合酶基因(NAS)是一种植物生长代谢中的关键酶基因,现已证实在植物铁离子吸收中具有重要作用。它催化合成的产物烟酰胺(NA),不仅是植物铁载体的合成前体,而且参与植物体内铁离子的转运、分配和贮存的活动,后来发现由于它对其他一些重金属离子也能起到转运的功效,因而显示出较强的重金属耐逆作用,表现出一定的植物修复功能。本实验采用农杆菌介导的油菜下胚轴转化方法,将水稻中的盐胁迫诱导基因(OsNAS1)转入甘蓝型油菜品种扬油6号中,主要实验结果如下:1.将携带pCambia2300-35S-OsNAS1-OCS质粒载体的农杆菌导入到甘蓝型油菜中,对油菜下胚轴的遗传转化体系进行了探索和优化处理。最终建立了油菜下胚轴高效遗传转化体系:即选取在MS培养基上生长4天的幼苗,切取其下胚轴并置于预培养基(MS + 1.0mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA,pH:5.8)上预培养3天,3天后在0D600=0.6的条件下经农杆菌侵染25min,置于共培养基(MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA + 5.0mg/L AgNO3,pH,5.8)上培养3天,之后将外植体转入分化筛选培养基(MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA + 5.0mg/L AgNO3 + 10mg/L Kan + 500mg/L Cef,pH,5.8)中进行分化筛选培养,以形成绿色幼苗。2.将筛选得到的较大幼苗,移入生根培养基(MS + 0.3 mg/L NAA + 10mg/L Kan + 500 mg/L Cef,pH,5.8)上生长,至其长出根后,将其移入壮苗培养基(1/2 MS)中壮苗。对获得的幼苗进行PCR分子鉴定,最终筛选得到转基因阳性植株50棵,其中18棵移栽入土壤中,开化后自交后收获种子。将收获的T0代种子与扬油6号亲本进行对比,发现其种子发育不良,表现出种子干瘪和籽粒较小,但其萌发后生长势要优于对照扬油6号。对T0代转基因种子进行盐胁迫下萌发指标的测定,结果发现转基因种子耐受盐碱胁迫的能力的确在一定程度上强于对照。3.将T1代转基因幼苗用20 mM的碳酸钠处理,9天后观察其生理变化,并测定其CAT和POD的酶活变化,以及根系活力。结果表明,T1代各株系的CAT酶活性均高于扬油6号(对照),而POD酶活力除了在T1-110这个株系中较高外,在对照和转基因T1代各株系之间并无显著差异,甚至出现一些株系中POD酶活力低于对照的现象。在根系活力实验中可发现,盐碱胁迫下,转基因T1代各株系的根系活力均强于对照扬油6号。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
第一部分文献综述  10-37
  1.1 油菜的基本概况  10
  1.2 盐、碱胁迫和植物应答反应  10-23
    1.2.1 盐、碱胁迫  10-12
    1.2.2 盐、碱胁迫下植物的应答反应  12-23
  1.3 抗逆油菜育种研究进展  23-37
    1.3.1 抗逆基因相关基因研究进展  23-37
第二部分材料与方法  37-48
  2.1 材料与仪器  37-41
    2.1.1 实验材料与常规试剂的配制  37-40
    2.1.2 实验中主要仪器设备  40-41
  2.2 实验方法  41-48
    2.2.1 农杆菌转化用培养基  41
    2.2.2 质粒 DNA 的制备  41-43
    2.2.3 油菜外植体的早期培养  43
    2.2.4 农杆菌转化油菜下胚轴体系的建立  43
    2.2.5 阳性转化植株的获得及分子鉴定  43-44
    2.2.6 T1 代与亲本之间表型的观察和遗传分析  44-45
    2.2.7 T1 代植株胁迫耐受表现和生理指标检测  45
    2.2.8 T1 代植株的盐胁迫处理后酶活性及根系活力测定  45-48
第三部分结果与分析  48-63
  3.1 农杆菌介导的下胚轴转化体系的优化  48-50
    3.1.1 苗龄天数对转化影响的比较  48
    3.1.2 外植体在不同预培养时间下对转化的影响  48
    3.1.3 侵染时间的比较  48-49
    3.1.4 侵染过程振荡对转化的影响  49
    3.1.5 共培养时间的比较  49
    3.1.6 转基因阳性苗的获得  49-50
  3.2 转基因苗的分子鉴定  50-51
  3.3 T0 代转基因株系种子与非转基因亲本种子的比较  51-53
  3.4 转基因 T1 代植株的 PCR 检测和遗传分析  53-54
  3.5 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下种子生理指标检测  54-59
    3.5.1 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下种子萌发状态观察  54-56
    3.5.2 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下种子萌发系数分析  56-57
    3.5.3 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下种子生物量累积分析  57
    3.5.4 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下幼苗根长和苗高比较  57-59
  3.6 T1 代幼苗在 20 mM 碳酸钠胁迫处理后植株的生理生化测验  59-63
    3.6.1 CAT 酶活测定  60-61
    3.6.2 POD 酶活测定  61
    3.6.3 根系活力测定  61-63
第四部分讨论  63-67
  4.1 农杆菌介导的下胚轴转化体系的优化  63-64
  4.2 T0 代种子 Na2CO3 胁迫下种子生理指标的分析  64-65
  4.3 T1 代幼苗在 20 mM 碳酸钠胁迫处理后植株的生理生化测验分析  65-67
参考文献  67-81
致谢  81

烟酰胺合酶基因的导入对甘蓝型油菜盐碱胁迫的响应

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