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牛病毒性腹泻病毒JZ05-1株基因分型、全基因序列测定及分析

作　者: 李庆超
导　师: 苗利光
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛病毒性腹泻病毒 3’-末端基因型全基因组相似性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科瘟病毒属的代表种,主要宿主为牛、羊、猪和鹿等,造成牛病毒性腹泻/粘膜病。目前该病毒在世界范围内广泛分布,特别是美国、新西兰等养牛业发达的国家。因此,牛病毒性腹泻病毒是造成全球乳/肉牛养殖业经济损失的主要病原体。根据遗传和抗原性差异,该病毒分为BVDV-1及BVDV-2两种基因型,BVDV-2急性感染所导致的临床症状更加严重。国内目前尚无商品化BVDV疫苗,国际上BVDV疫苗以BVDV-1株为主,加之BVDV毒株间交叉免疫保护性不强,亟待加强对BVDV-2型疫苗的研究。本研究以一株培养特性稳定、免疫原性好、无致病性的BVDV毒株,分离于我国的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1毒株,为研究对象。通过基因型鉴定、全基因序列测定以及生物信息学分析方法研究其遗传背景及毒株特性。BVDV JZ05-1毒株感染MDBK细胞后导致典型的致细胞病变效应,是一株cpe生物型毒株。荧光抗体检测和RT-PCR基因分型结果表明该病毒为一株BVDV-2毒株。牛病毒性腹泻病毒基因组为单股正链RNA,无Poly(A)尾,因此传统的3’-RACE方法不适用于BVDV的3’-末端克隆测序。本研究根据BVDV基因组3’-末端共有特征碱基(GCn),设计回文锚定引物CGend。以BVDV JZ05-1毒株为研究对象,进行了反转录及3’-末端克隆测序。结果表明,CGend的反转录效果优于随机引物和一般下游特异性引物,并且扩增得到了JZ05-1的3’-末端序列。本研究为瘟病毒属病毒的反转录和3’-末端克隆测序提供了新的实验思路。使用逆转录-聚合酶链式反应方法分别扩增覆盖基因组全长的八个片段并克隆测序,拼接获得该病毒的全基因序列长12285核苷酸,GenBank登录号:GQ888686。该病毒基因组具有一个11 694 nt可读框编码多聚蛋白,5’-UTR长387 nt、3’-UTR长204 nt。对BVDV JZ05-1的5’-UTR和全基因序列分别进行分析,发现该病毒为BVDV-2a亚型。BVDV-2型多数毒株之间相似性约为96%。JZ05-1全基因组序列与加拿大p11Q毒株和中国XJ-04毒株的相似性最高,为90%和91%。可见,JZ05-1全基因组序列与BVDV-2型其他毒株序列具有较大差异。JZ05-1非编码区RNA与其他BVDV-2毒株相比,具有独特的二级结构域,碱基突变除发生在可变区外,主要存在于颈环结构交界处。BVDV基因组无大段插入、缺失,点突变多数为中性突变,氨基酸残基突变主要为非极性小侧链氨基酸间替换。RdRp蛋白中可变氨基酸主要位于可及性较好的蛋白分子表面,氨基酸的突变一般不影响蛋白质的三级结构和酶活性中心。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章绪论  14-29
  1.1 病原学  14-16
    1.1.1 研究历史  14
    1.1.2 分类地位及分型  14-16
    1.1.3 一般生物学特性  16
  1.2 分子生物学研究  16-21
    1.2.1 病毒粒子结构组成及功能  16-17
    1.2.2 病毒复制周期及蛋白裂解过程  17-18
    1.2.3 致细胞病变及免疫逃逸机制  18-20
    1.2.4 亚基因组  20
    1.2.5 展望  20-21
  1.3 流行病学  21-22
    1.3.1 宿主及流行状况  21
    1.3.2 传播  21-22
    1.3.3 临床表现  22
  1.4 抗原分布及发病机制  22-25
    1.4.1 抗原分布  22-23
    1.4.2 急性感染的发病机理  23
    1.4.3 子宫内感染的发病机理  23-24
    1.4.4 粘膜病及慢性粘膜病的发病机理  24-25
  1.5 BVDV 检测  25-26
    1.5.1 检测方法  25
    1.5.2 急性感染  25
    1.5.3 持续性感染  25-26
    1.5.4 畜群筛查  26
  1.6 预治及疫苗  26-28
    1.6.1 预防治疗  26-27
    1.6.2 疫苗  27-28
  1.7 本研究的目的和意义  28-29
第二章病毒培养、荧光抗体及 RT-PCR 分型鉴定  29-34
  2.1 材料与方法  29-30
    2.1.1 病毒、细胞及试剂仪器  29
    2.1.2 病毒培养  29
    2.1.3 荧光抗体鉴定  29-30
    2.1.4 RNA 提取及 RT-PCR  30
  2.2 试验结果  30-33
    2.2.1 病毒培养特性  30
    2.2.2 荧光抗体鉴定  30
    2.2.3 基因型鉴定  30-33
  2.3 讨论  33-34
第三章反转录及3’-末端克隆测序方法研究  34-39
  3.1 材料和方法  34-37
    3.1.1 毒株与材料  34
    3.1.2 病毒培养及RNA 提取  34-35
    3.1.3 引物设计  35
    3.1.4 RT-PCR、产物克隆及测序  35-37
  3.2 试验结果  37-38
    3.2.1 C 片段扩增及cDNA 模板比较  37-38
    3.2.2 P7 片段扩增及测序  38
  3.3 讨论  38-39
第四章 BVDV JZ05-1 分离株全基因测序  39-45
  4.1 材料和方法  39-41
    4.1.1 毒株与材料  39
    4.1.2 病毒培养  39-40
    4.1.3 引物设计  40
    4.1.4 病毒RNA 提取以及RT-PCR 扩增  40-41
    4.1.5 扩增片段克隆测序及全基因序列拼接  41
  4.2 试验结果  41-43
    4.2.1 基因组片断RT-PCR 扩增  41
    4.2.2 PCR 产物克隆、测序及拼接  41-43
  4.3 讨论  43-45
第五章 BVDV JZ05-1 分离株基因组序列分析  45-53
  5.1 材料与方法  45-46
    5.1.1 BVDV 基因组序列及生物信息学软件  45
    5.1.2 基因型以及系统发育树分析  45-46
    5.1.3 非编码区RNA 二级结构预测  46
    5.1.4 结构蛋白编码区突变分析  46
    5.1.5 同源建模及蛋白突变分析  46
  5.2 结果  46-49
    5.2.1 基因型以及系统发育树分析  46-47
    5.2.2 非编码区RNA 二级结构  47-49
    5.2.3 结构蛋白编码区序列突变  49
    5.2.4 RdRp 同源建模  49
  5.3 讨论  49-53
第六章全文结论  53-54
参考文献  54-62
致谢  62-63
附录  63-65
作者简历  65

牛病毒性腹泻病毒JZ05-1株基因分型、全基因序列测定及分析

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