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脱氮关键酶基因的克隆、鉴定及高效脱氮菌株的构建

作　者: 刘钰莹
导　师: 许雷
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 生物脱氮 氨单加氧酶 亚硝酸盐还原酶 基因敲除 高效脱氮菌株
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 100次
引　用: 2次
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内容摘要


以中华根瘤菌NP1 (Sinorhizobium sp.NP1)为原始菌株,通过同源克隆与Tail-PCR的方法,获得氨单加氧酶基因(amo)的全基因序列与亚硝酸盐还原酶基因(nir)的全基因序列。amo基因全长1089 bp,编码362个氨基酸, AMO存在信号肽,蛋白的成熟位点在第37-38的VLA-SF之间,有九个跨膜区段;nir基因全长1137 bp,编码378个氨基酸,NIR与裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)NIR的二级结构和三级结构相似,NIR中存在信号肽,蛋白的成熟位点在第33-34的AHA-AG之间,该蛋白前50个氨基酸内有一个跨膜螺旋信号。以自杀穿梭质粒pJQ200SK为原始载体,构建NP1 amo基因敲除质粒pJQ200SK-amo-Tc。采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得amo基因敲除菌株NP1::amo。通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,发现NP1::amo的脱氮效率比原始菌株NP1下降约35%,该结果表明本实验中所克隆的氨单加氧酶基因为脱氮关键酶基因。采用组成型启动子D型乳酸脱氢酶启动子(dld)加强amo基因的表达,以克隆载体pBBR1MCS-5为原始载体,构建NP1 amo基因增强表达的质粒载体p5:dld-amo。采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得重组菌株NP1::dld-amo。通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,NP1::dld-amo的脱氮效率比NP1提高了10%左右。质粒稳定性检测显示质粒能够在NP1中稳定存在12代以上。克隆gfp绿色荧光蛋白基因与dld-amo融合表达,以克隆载体pBBR1MCS-5为原始载体,构建完成克隆质粒p5:dld-amo-gfp并将其转入到大肠杆菌中对amo基因表达进行定位,荧光显微镜下观察到微弱的绿色荧光,可以初步推测氨单加氧酶为膜内蛋白。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章 绪论  12-18
  1.1 研究背景  12-13
    1.1.1 水体氮污染的现状  12
    1.1.2 氮污染的来源与危害  12-13
  1.2 生物脱氮  13-15
    1.2.1 生物脱氮的机理  13-14
    1.2.2 生物脱氮方法  14-15
  1.3 氨单加氧酶与亚硝酸盐还原酶  15-17
    1.3.1 氨单加氧酶基因的分子研究  15-16
    1.3.2 亚硝酸盐还原酶基因的分子研究  16-17
  1.4 研究的目的与意义  17-18
第二章 材料与方法  18-24
  2.1 材料  18-19
    2.1.1 菌株和质粒  18
    2.1.2 培养基  18
    2.1.3 试剂  18-19
    2.1.4 实验仪器  19
  2.2 方法  19-24
    2.2.1 细菌基因组 DNA 的提取  19
    2.2.2 质粒 DNA 的提取  19-20
    2.2.3 JM110 感受态的制备  20
    2.2.4 DNA 片段的回收  20-21
    2.2.5 连接产物的转化  21
    2.2.6 Tail-PCR  21
    2.2.7 DNA 序列测定及分析  21-22
    2.2.8 SDS-PAGE  22
    2.2.9 三亲本杂交  22-23
    2.2.10 氨氮的定量测定  23
    2.2.11 其他方法  23-24
第三章 结果与分析  24-63
  3.1 氨单加氧酶基因的克隆与序列分析  24-33
    3.1.1 氨单加氧酶基因上游序列的获得  24-26
    3.1.2 氨单加氧酶基因下游序列的获得  26-28
    3.1.3 氨单加氧酶全基因序列的获得  28-30
    3.1.4 氨单加氧酶基因序列分析  30-33
    3.1.5 小结  33
  3.2 亚硝酸盐还原酶基因的获得表达与序列分析  33-46
    3.2.1 亚硝酸盐还原酶基因上游序列的获得  34-35
    3.2.2 亚硝酸盐还原酶基因下游序列的获得  35-37
    3.2.3 亚硝酸盐还原酶全基因序列的获得  37-38
    3.2.4 亚硝酸盐还原酶全基因序列分析  38-43
    3.2.5 亚硝酸盐还原酶基因的原核表达  43-46
    3.2.6 小结  46
  3.3 氨单加氧酶基因功能鉴定  46-50
    3.3.1 amo 基因敲除载体的构建与鉴定  46-48
    3.3.2 amo 基因敲除菌株的筛选  48-49
    3.3.3 amo 基因敲除菌株脱氮活性的测定  49-50
    3.3.4 小结  50
  3.4 高效脱氮菌株的构建  50-58
    3.4.1 乳酸脱氢酶dld 启动子的克隆  50-52
    3.4.2 Soe-PCR 获得dld-amo 的基因片段  52-53
    3.4.3 p5:dld-amo 克隆载体的构建与鉴定  53-55
    3.4.4 重组菌株的筛选  55
    3.4.5 重组菌株脱氮活性的测定  55-56
    3.4.6 质粒稳定性检测  56-57
    3.4.7 小结  57-58
  3.5 氨单加氧酶基因表达定位  58-63
    3.5.1 Soe-PCR 获得dld-amo-gfp 融合基因片段  58-60
    3.5.2 克隆载体p5：dld-amo-gfp 的构建与鉴定  60-61
    3.5.3 大肠杆菌重组菌株中的定位  61-62
    3.5.4 小结  62-63
第四章 全文结论  63-65
  4.1 氨单加氧酶基因克隆与亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达  63
  4.2 氨单加氧酶基因功能的鉴定  63
  4.3 高效脱氮菌株的构建  63-64
  4.4 氨单加氧酶基因表达部位的初步探索  64-65
参考文献  65-71
致谢  71-72
附录  72-73
作者简历  73

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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