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泛素连接酶RNF2与MANF的相互作用及其神经保护作用

作　者: 陈滢
导　师: 沈玉先
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: MANF RNF2 酵母双杂交技术神经保护
分类号: R969.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor，MANF）是一种分泌性蛋白，在内质网应激（Endoplasmicreticulumstress, ER stress)情况下可上调表达，对缺血的心、脑具有保护作用，并对体外培养的原代神经细胞具有保护作用，且具有抑制炎症的作用，但MANF的具体作用机制仍不明确。我们通过酵母双杂交系统筛选人胚胎脑cDNA文库，寻找与MANF相互作用蛋白，为进一步研究MANF的功能机制奠定基础。通过酵母双杂交筛选出7个与MANF相互作用的蛋白，RNF2蛋白是其中之一。RNF2是Polycomb group（PcG）家族的成员，过表达同属PcG家族的SCMH1或BMI1蛋白可减轻缺血耐受大鼠的神经损伤，并且RNF2在缺血耐受大鼠脑和视网膜中表达上调，据此我们推测RNF2可能也具有神经保护作用。本研究通过体内和体外实验验证MANF和RNF2的相互作用，在大鼠脑缺血再灌注的模型中观察RNF2和MANF在缺血皮层中的表达及共定位情况，并观察过表达或沉默RNF2对体外诱导ER应激的神经细胞损伤的影响，以证实RNF2与MANF的相互作用及其神经保护作用。目的：1、筛选与MANF相互作用的蛋白；2、验证RNF2与MANF的相互作用；3、观察RNF2的神经保护作用。方法：用酵母双杂交系统筛选与MANF相互作用的蛋白，结果筛选出7个与MANF相互作用的蛋白，RNF2就是其中之一。再分别用酵母共转、体外Pull down、免疫共沉淀、细胞免疫荧光、核浆分离等方法验证RNF2和MANF的相互作用；线栓法制作SD大鼠脑缺血再灌注（MCAO）模型，采用免疫荧光双标方法检测RNF2和MANF在MCAO模型大鼠脑组织皮质部位的表达和定位情况；用tunicamycin（TM）处理N2A细胞，诱导ER应激，过表达或沉默RNF2后，用免疫印迹法检测CHOP和激活的caspase-3的表达水平，并用PI染色观察细胞死亡情况。结果：1.用酵母双杂交方法筛选与MANF相互作用的蛋白1.1诱饵质粒pGBKT7-MANF的毒性及自激活效应检测构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-MANF，分别将空载体pGBKT7和诱饵质粒pGBKT7-MANF小规模转化酵母Gold菌，待长出较密克隆后，分别挑取直径相同的Gold pGBKT7和Gold pGBKT7-MANF，在3ml的YPDA液体培养基培养过夜后，600nm的吸光度分别为1.25和1.24，表明诱饵质粒pGBKT7-MANF对酵母没有毒性，不影响酵母的正常生长。Gold pGBKT7-MANF在SD/-His/-Trp营养缺陷板上不生长，在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落，说明pGBKT7-MANF没有自身报告基因激活的能力。1.2检测bait阳性酵母克隆中MANF融合蛋白的表达为了进一步确定酵母转化的阳性克隆中确实表达MANF的融合蛋白，我们用IB的方法检测了酵母裂解液中的MANF蛋白。结果显示：转化空载体pGBKT7的酵母表达分子量约25KD的载体蛋白。与对照相比，转化pGBKT7-MANF的酵母蛋白样品中所检测到的融合蛋白分子量约为45kd，与预期相符。说明pGBKT7-MANF在酵母中可以表达。1.3酵母融合与阳性克隆的筛选将转化了诱饵质粒的酵母与转化了人胚胎脑文库的酵母菌株共同孵育结合，在倒置显微镜下观察到大量三叶草状二倍体细胞时终止孵育。然后将菌液涂布于60块TDO平板上筛选出180个阳性克隆。挑取直径大的克隆，点在QDO/X平板上，筛选出17个变蓝的克隆。从QDO/X平板上挑取深蓝色克隆，反复3次划线于DDO/X平板上，去掉2个假阳性克隆，再将DDO/X平板上筛选所得的所有纯蓝色阳性克隆反复3次划线于QDO/X平板上，得到15个纯蓝色的阳性克隆。1.4基因序列的测定与分析将筛选出的15个阳性酵母克隆做菌落PCR，排除掉PCR产物大小一致的克隆。提取阳性克隆质粒电转化大肠杆菌后提取质粒，进一步经核苷酸序列测定，并与GenBank数据库进行同源性比较，发现7个与人MANF相互作用的蛋白，RNF2蛋白为其中之一。2.酵母回复性杂交验证RNF2和MANF的相互作用将RNF2全长编码序列构建到pGADT7载体上，将pGBKT7-MANF和pGADT7-RNF2共转化到酵母Gold菌株进行回复性杂交。结果显示：共转化后的酵母可以在营养缺陷培养基QDO/X上正常生长并呈现蓝色，提示在酵母中RNF2确实能与MANF相互作用。3. GST pull-down证明RNF2和MANF有直接的相互作用为进一步明确在酵母体系中筛选出的RNF2和MANF相互作用，我们表达并纯化GST-RNF2蛋白和MANF-his蛋白。将纯化的两种蛋白混合后进行GSTpull-down实验。结果表明，RNF2能与MANF特异性的结合，证明RNF2和MANF有直接的相互作用。4.免疫共沉淀证实MANF与RNF2相互作用为了进一步研究MANF与RNF2是否在真核细胞内相互作用，我们建立了稳定转染GFP-MANF的细胞系N2A-MANF，用RNF2抗体沉淀稳定转染细胞系N2A-MANF中的RNF2蛋白，再用GFP抗体检测免疫沉淀物中是否含有MANF。结果表明，在真核细胞内RNF2可以与MANF相互作用。5. ER应激诱导神经细胞中的MANF入核，与RNF2相互作用5.1ER应激诱导神经细胞中的MANF与RNF2共定位于细胞核本课题组前期的研究发现，ER应激可以诱导神经细胞中MANF的核转运。本研究中我们想了解是否MANF与RNF2在神经细胞核内可以相互作用。我们用tunicamycin（4μg/ml）刺激N2A细胞，16hrs后收集细胞做免疫荧光染色，观察MANF和RNF2的共定位情况。结果显示，未经tunicamycin刺激的N2A中，RNF2蛋白为细胞核定位的蛋白，而MANF蛋白主要分布于胞浆。经tunicamycin刺激后，MANF在细胞核内的含量明显增多，并与RNF2共定位。5.2免疫共沉淀证实MANF与RNF2在细胞核内相互作用在N2A细胞中转染MANF-FLAG质粒，用tunicamycin（4μg/ml）刺激N2A细胞，16hrs后收集细胞分离细胞核和细胞浆蛋白，用FLAG抗体分别沉淀胞浆和胞核的MANF蛋白，IB检测免疫沉淀物中是否含有RNF2。结果表明，RNF2和MANF在细胞核内相互作用，且在ER应激下相互作用明显增强。6.ER应激诱导神经细胞中RNF2的表达为了观察ER应激状态下RNF2的表达情况，我们在N2A中给予ER应激诱导剂tunicamycin（4μg/ml）处理16hrs，IB检测结果发现MANF和RNF2的表达都显著上调。说明ER应激同样能诱导神经细胞中RNF2的表达。7.轻度脑缺血再灌注损伤诱导神经细胞中的RNF2表达及其与MANF的共定位为了观察RNF2在大鼠脑缺血再灌注损伤的大脑皮层中的表达情况和与MANF的共定位情况，我们用线栓法制作SD大鼠脑缺血再灌注模型，用免疫荧光双标方法观察MANF和RNF2的表达和定位情况。结果发现：在缺血再灌注24hrs的大脑皮层中，RNF2和MANF的表达均上调，且共定位。而在缺血再灌注48hrs后，皮层水肿严重，RNF2和MANF几乎不表达，提示轻度脑缺血再灌注损伤可以诱导神经细胞中RNF2和MANF的表达。8. RNF2knockdown并验证应用RNAi技术对N2A细胞中内源性的RNF2进行敲低。转染RNF2-siRNA后分别于24hrs，48hrs，36hrs和72hrs收取细胞，提取蛋白检测RNF2蛋白质水平的变化。结果显示：转染36hrs～48hrs RNF2的沉默效率最高。9. RNF2可以减少ER应激介导的神经细胞的死亡在N2A细胞中瞬时转染RNF2的过表达质粒或siRNA，经TM处理16hrs或不经TM处理后进行PI染色，并对染色阳性细胞进行计数分析。结果发现在TM处理的实验组中，过表达RNF2能减少PI染色阳性的细胞数，沉默内源性的RNF2能明显增加PI染色阳性的细胞数，提示RNF2可以抑制ER应激介导的细胞死亡。10. RNF2通过抑制caspases-3的活化减少ER应激介导的神经细胞的凋亡我们在N2A细胞中瞬时转染RNF2的过表达质粒或siRNA，经TM处理16hrs或不经TM处理，IB检测结果发现TM处理后CHOP和激活的caspase-3表达明显增加，RNF2过表达和knockdown分别抑制和增加caspase-3的活化，但对CHOP表达的影响却不大。以上实验结果提示RNF2可以通过抑制caspases-3的活化减少ER应激介导的神经细胞的凋亡，从而起到神经保护作用。结论：1. RNF2与MANF有相互作用；2. RNF2具有神经保护作用，且可能通过抑制caspase-3的激活而抑制ER应激诱导的细胞凋亡。

全文目录

英文缩略词表（ABBREVIATION）  9-11
中文摘要  11-17
英文摘要  17-24
1 前言  24-26
2 实验材料  26-32
  2.1 实验动物  26
  2.2 菌株、细胞株及质粒  26-27
  2.3 抗体  27
  2.4 主要试剂和试剂盒  27-28
  2.5 引物和SIRNA  28-29
  2.6 主要仪器与设备  29-30
  2.7 主要试剂和溶液的配方  30-32
3 实验方法  32-48
  3.1 重组质粒的构建及质粒提取  32-36
    3.1.1 引物设计和合成  32
    3.1.2 PCR 扩增  32
    3.1.3 凝胶回收  32-33
    3.1.4 酶切  33
    3.1.5 连接  33
    3.1.6 DH5α感受态细胞的制备  33
    3.1.7 连接产物和质粒转化  33-34
    3.1.8 质粒的小量提取  34
    3.1.9 重组质粒的鉴定  34-35
    3.1.10 质粒的中量提取  35-36
  3.2 SIRNA 的合成  36
  3.3 免疫印迹（IMMUNOBLOTTING，IB）  36-37
    3.3.1 蛋白样品制备  36
    3.3.2 SDS-PAGE 凝胶制备  36-37
    3.3.3 上样电泳  37
    3.3.4 转膜  37
    3.3.5 IB 检测  37
  3.4 RT-PCR  37-39
    3.4.1 RNA 提取  37-38
    3.4.2 RT 反应  38
    3.4.3 PCR 扩增  38-39
  3.5 酵母双杂交（YEAST TWO HYBRID，Y2H）  39-42
    3.5.1 小规模转化酵母菌  39
    3.5.2 酵母提蛋白  39-40
    3.5.3 Bait－BD 与文库融合，筛选  40-41
    3.5.4 酵母质粒 DNA 的提取  41
    3.5.5 大肠杆菌电转化感受态细胞制备  41-42
    3.5.6 文库质粒 DNA 电转化大肠杆菌  42
  3.6 细胞培养及转染  42-43
  3.7 GST PULL DOWN  43-45
    3.7.1 表达 GST 标签融合蛋白  43
    3.7.2 表达 His 标签融合蛋白  43-44
    3.7.3 纯化 GST 标签融合蛋白  44
    3.7.4 纯化 His 标签融合蛋白  44
    3.7.5 pull down  44-45
  3.8 免疫共沉淀（CO-IMMUNOPRECIPITATION，CO-IP）  45
  3.9 核浆分离实验  45-46
  3.10 细胞免疫荧光染色  46
  3.11 稳定转染细胞系的建立  46-47
  3.12 PI 染色  47
  3.13 脑组织免疫荧光染色  47-48
4 结果  48-65
  4.1 诱饵表达质粒 PGBKT7-MANF 的构建和鉴定  48
  4.2 诱饵质粒 PGBKT7-MANF 的毒性及自激活效应检测  48-49
  4.3 检测 BAIT 阳性酵母克隆中 MANF 融合蛋白的表达  49-50
  4.4 酵母融合与阳性克隆的筛选  50-51
  4.5 阳性克隆基因序列的测定与分析  51-53
  4.6 酵母回复性杂交  53-54
    4.6.1 酵母表达质粒 pGADT7-RNF2 的构建与鉴定  53
    4.6.2 酵母回复性杂交验证 MANF 和 RNF2 相互作用  53-54
  4.7 GST PULL-DOWN 证明 RNF2 和 MANF 有直接的相互作用  54-55
  4.8 免疫共沉淀证实 MANF 与 RNF2 相互作用  55-58
    4.8.1 稳定转染细胞系 N2A-MANF 的建立  55-57
    4.8.2 免疫共沉淀证实 MANF 与 RNF2 相互作用  57-58
  4.9 ER 应激诱导 MANF 与 RNF2 在神经细胞核中相互作用  58-60
    4.9.1 ER 应激诱导神经细胞中的 MANF 与 RNF2 共定位于细胞核50  58-59
    4.9.2 免疫共沉淀证实 MANF 与 RNF2 在细胞核内相互作用  59-60
  4.10 ER 应激诱导神经细胞中 RNF2 的表达  60-61
    4.10.1 ER 应激诱导神经细胞中 RNF2 表达上调  60
    4.10.2 轻度脑缺血再灌注损伤诱导神经细胞中的 RNF2 表达及其与MANF 的共定位  60-61
  4.11 RNF2 可以减少 ER 应激介导的神经细胞的死亡  61-64
  4.12 RNF2 抑制 CASPASES-3 的活化  64-65
5 讨论  65-69
6 结论  69
7 本研究的创新点  69
8 参考文献  69-77
附录  77-79
致谢  79-81
综述  81-97
  参考文献  90-97

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