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羧胺三唑的抗肿瘤作用及部分机制研究

作　者: 武丹威
导　师: 张德昌
学　校: 北京协和医学院
专　业: 药理学
关键词: 羧胺三唑 巨噬细胞 细胞因子 癌症 地塞米松
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景癌症是严重威胁人类健康的疾病之一。因此,寻找高效低毒,作用靶点明确的抗肿瘤药物或者有效的联合用药方案是当前药理学以及临床治疗学共同关注的热点问题。羧胺三唑(Carboxyamidotriazole, CAI)是一种非细胞毒类的抗肿瘤药物,能抑制体内,体外多种肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡。先前的研究认为其作用机制与CAI抑制钙离子跨膜内流有关,但其分子机制尚无定论。我们课题组在深入研究CAI药理作用的过程中,发现CAI不仅具有抗肿瘤作用,还在一系列急、慢性炎症模型中表现出良好的抗炎作用,其作用机制与下调动物炎症部位或巨噬细胞释放炎性细胞因子有关。近年来基础和临床研究表明癌症与慢性炎症之间存在联系。其中一个联系点就是在炎癌发展中均发挥重要作用的巨噬细胞。在肿瘤发展的过程中,肿瘤微环境中的巨噬细胞和相关促炎细胞因子会扮演“帮凶”的角色,促进肿瘤的生长,转移。目前针对肿瘤内巨噬细胞和某些促炎因子治疗癌症已得到广泛认可和接受。综合以上背景,我们提出以下假说：CAI是否是通过作用于在炎、癌过程中均发挥重要作用的巨噬细胞而起抗炎及抗癌作用。CAI除能抑制炎症模型中促炎细胞因子释放,是否也能抑制肿瘤微环境中促炎细胞因子的产生。同时,如果以上假说成立,我们是否能够将CAI与另一种抑制炎性细胞因子的药物合用,以增强CAI的抗肿瘤疗效。在本项课题中,我们将围绕以上工作假说展开研究。研究方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAI对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞及佐剂性关节炎(AA)大鼠腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-a)的影响；采用逆转录-聚合酶链式反应实验(RT-PCR)检测CAI对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-a mRNA表达的影响；通过DNFB诱导的迟发型超敏反应考察CAI对细胞免疫的影响：通过中性红实验考察CAI对非特异性免疫的影响；建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌(LLC)移植瘤模型,以肿瘤生长、动物体重、生存期和血管生成等指标评价CAI及COM组(CAI与DEX合用,Combination, COM)对移植瘤模型的疗效；采用免疫组化的方法观察肿瘤组织中TNF-a表达情况；采用ELISA法检测肿瘤组织匀浆中TNF-a的水平；采用免疫荧光法鉴定从肿瘤内提取巨噬细胞,采用RT-PCR法检测肿瘤内巨噬细胞TNF-a mRNA的表达水平。建立A549裸鼠移植瘤模型,以肿瘤生长,生存期,血管生成等指标来评价CAI及COM组对移植瘤模型的疗效；采用ELISA法检测肿瘤组织匀浆和腹腔巨噬细胞中TNF-a, TGF-p的水平。采用ELISA法检测CAI及COM组对肿瘤条件培养基(LCM)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α水平的影响；采用CCK-8法检测CAI及COM组对单独培养的LLC细胞增殖的影响；建立小鼠腹腔巨噬细胞与LLC细胞共培养模型,采用CCK-8法测定腹腔巨噬细胞对LLC细胞增殖的作用及药物对此作用的影响。采用ELISA法及RT-PCR法检测CAI及COM组对LCM诱导RAW264.7细胞TNF-a,IL-6水平的影响；建立小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与LLC细胞共培养模型,采用结晶紫染料测定RAW264.7细胞对LLC细胞侵袭,迁移的作用及药物对此作用的影响。研究结果1. CAI (40能够明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-a的水平,抑制率为35.36%(p<0.01)。 CAI (10,20μmol/L)均能够明显抑制RAW264.7细胞TNF-a mRNA表达(p＜0.01)。2. CAI (20mg/kg)对AA大鼠腹腔巨噬细胞释放炎性细胞因子TNF-α有明显抑制作用(p＜0.01)。3. CAI (20mg/kg)对DNFB所诱导的小鼠迟发型超敏反应没有抑制作用。CAI(5、10、20和40μmol/L)对体外培养正常大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能没有影响。4. CAI (20mg/kg)对LLC移植瘤模型中肿瘤的生长,血管生成有一定抑制作用。同时可延长荷瘤动物的生存期。与小剂量DEX (1mg/kg)联合用药后,药物的疗效优于两种药物单独使用时的效果。同时各给药组动物体重之间没有明显差异。5. CAI (20mg/kg)对LLC移植瘤模型中肿瘤组织的TNF-a水平有抑制作用,与小剂量DEX (1mg/kg)联合用药后,抑制作用优于单用药组。6. CAI (20mg/kg)对于LLC移植瘤模型中肿瘤内巨噬细胞TNF-α mRNA表达有明显抑制作用(p＜0.01),与小剂量DEX (1mg/kg)联合用药后,抑制作用优于单用药组(p＜0.01)。7. CAI (20mg/kg)对A549移植瘤模型中肿瘤的生长,血管生成有一定抑制作用。与小剂量DEX联合用药后,药物的疗效优于两种药物单独使用时的效果。8. CAI (20mg/kg)对A549移植瘤模型肿瘤组织匀浆TNF-α和TGF-β水平有一定抑制作用,与小剂量DEX联合用药后,抑制作用优于单用药组。CAI(20mg/kg)对A549移植瘤模型中裸鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的释放有明显的抑制作用(p＜0.01),与小剂量DEX联合用药后,抑制作用优于单用药组。9. CAI (5、10、20、40μmol/L)对单独培养的LLC细胞的增殖有明显抑制作用(p＜0.01),并呈时间剂量依赖关系。DEX对LLC细胞的增殖没有影响；CAI与小剂量DEX合用对LLC细胞的增殖抑制作用与单独应用CAI相比,没有增强。10. CAI (30μmol/L)能够抑制LCM诱导小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-a, IL-6的水平,升高IL-10的水平。CAI与DEX (10μmol/L)合用能够明显抑制TNF-α,IL-6含量,其抑制作用优于单用药情况(p＜0.05)。11.将小鼠腹腔巨噬细胞与LLC细胞共培养可促进LLC细胞的增殖。CAI和DEX对LLC细胞的增殖均具有明显抑制作用(p＜0.05)。CAI和DEX合用对LLC细胞的增殖抑制作用优于单用药情况(p＜0.01)。12. CAI (20在一定程度上能够抑制LCM诱导RAW264.7细胞释放TNF-a, IL-6的水平。与DEX (10μmol/L)合用后,其抑制作用优于单用药情况。13. CAI (30能够抑制LCM诱导RAW264.7细胞TNF-a, IL-6mRNA的表达(p＜0.01)。与DEX (10μmol/L)合用,抑制TNF-a, IL-6mRNA表达更明显。单用CAI (20μmol/L)也能够抑制LCM诱导RAW264.7细胞IL-1mRNA表达(p＜0.01)。CAI和DEX (10μmol/L)合用抑制IL-1mRNA表达,与单用药相比,具有极显著性差异(p＜0.01)。14.侵袭,迁移实验结果显示：CAI (30μmol/L)和DEX (10μmol/L)均能够抑制RAW264.7细胞对LLC细胞迁移和侵袭的促进作用。尤其是CAI和DEX合用对LLC细胞的增殖迁移和侵袭作用,与单用药相比,具有极显著性差异(p<0.05)。结论1.CAI不仅具有抗肿瘤作用,而且还通过抑制炎性细胞因子的释放而发挥抗炎作用。2.CAI的抗肿瘤作用机制与抑制肿瘤微环境中细胞因子的产生有关,从而间接影响肿瘤增殖、迁移、侵袭和肿瘤组织内的血管新生。3.CAI与小剂量DEX联合用药通过进一步抑制炎性细胞因子的释放增强CAI的抗肿瘤作用,降低不良反应。打破CAI单独使用抗肿瘤作用较弱的瓶颈。4.CAI兼具抗肿瘤及抗炎作用,因此可作为探索炎～癌关系的工具药物。同时通过对CAI作用机制的研究,可能能够发现炎～癌转化过程中其它关键物质,对于明确炎～癌转化的分子网络,具有重要意义。

全文目录


目录  3-9
摘要  9-13
Abstract  13-17
缩略术语表  17-19
前言  19-22
第一部分：羧胺三唑的抗炎作用机制研究  22-36
  1. 前言  22
  2. 实验材料  22-25
    2.1. 实验动物  22
    2.2. 细胞系  22
    2.3. 试剂及材料  22-24
      2.3.1. 一般药品  22-23
      2.3.2. 细胞培养材料  23-24
      2.3.3. 试剂盒  24
      2.3.4. 荧光定量RT-PCR材料  24
    2.4. 主要仪器  24-25
  3. 实验方法  25-30
    3.1. 常用溶液配制  25-26
    3.2. LPS诱导的RAW264.7细胞  26-28
      3.2.1. RAW264.7细胞复苏  26-27
      3.2.2. RAW264.7细胞培养与计数  27
      3.2.3. RAW264.7细胞冻存  27-28
      3.2.4. 细胞因子检测  28
      3.2.5. 荧光定量RT-PCR  28
    3.3. AA大鼠模型  28-29
      3.3.1. AA大鼠模型的建立及给药方式  28-29
      3.3.2. AA大鼠腹腔巨噬细胞的提取  29
      3.3.3. 细胞因子检测  29
    3.4. 小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型的建立及给药方式  29
    3.5. 中性红实验  29-30
    3.6. 统计学方法  30
  4. 实验结果  30-35
    4.1. CAI对LPS诱导的RAW264.7细胞炎性细胞因子水平的影响  30-32
      4.1.1. CAI对LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α的影响  30-32
      4.1.2. CAI对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α mRNA表达影响  32
    4.2. CAI对AA大鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的影响  32-33
    4.3. CAI对非特异性免疫及细胞免疫的影响  33-35
      4.3.1. CAI对小鼠迟发型超敏反应的影响  33-35
      4.3.2. CAI对体外培养正常大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响  35
  5. 小结  35-36
第二部分：羧胺三唑对两种移植瘤动物模型的药效学评价和作用机制研究  36-64
  1. 前言  36
  2. 实验材料  36-40
    2.1. 实验动物  36
    2.2. 细胞系  36-37
    2.3. 试剂及材料  37-39
      2.3.1. 一般药品  37
      2.3.2. 细胞培养材料  37-38
      2.3.3. 抗体  38
      2.3.4. 冰冻切片及免疫组化(荧光)染色材料  38-39
      2.3.5. 组织匀浆材料及总蛋白测定材料  39
      2.3.6. 试剂盒  39
      2.3.7. 荧光定量RT-PCR材料  39
    2.4. 主要仪器  39-40
  3. 实验方法  40-51
    3.1. 常用溶液配制  40-42
    3.2. 细胞复苏  42-43
    3.3. 细胞培养与计数  43
    3.4. 细胞冻存  43-44
    3.5. 小鼠LLC移植瘤模型建立及相关检测  44-48
      3.5.1. 建立小鼠LLC移植瘤模型  44
      3.5.2. 实验分组及给药方案  44-45
      3.5.3. 样品收集与处理  45-46
      3.5.4. Bradford法测定蛋白浓度  46
      3.5.5. 细胞因子检测  46
      3.5.6. LLC肿瘤组织冰冻切片及免疫组化染色  46-47
      3.5.7. LLC肿瘤组织内巨噬细胞F4/80免疫荧光染色  47-48
      3.5.8. LLC肿瘤组织内巨噬细胞荧光定量RT-PCR  48
    3.6. 裸鼠A549移植瘤模型建立及相关检测实验  48-51
      3.6.1. 建立裸鼠A549移植瘤模型  48-49
      3.6.2. 实验分组及给药方案  49
      3.6.3. 样品的收集与处理  49-50
      3.6.4. Bradford法测定蛋白浓度  50
      3.6.5. 细胞因子检测  50
      3.6.6. A549肿瘤组织冰冻切片及免疫荧光染色  50-51
    3.7. 统计学方法  51
  4. 实验结果  51-63
    4.1. CAI和/或DEX对LLC移植瘤模型的药效学评价和作用机制研究  51-59
      4.1.1. CAI和/或DEX对肿瘤生长及动物体重的影响  51-53
      4.12. CAI和/或DEX对荷瘤小鼠生存期的影响  53-54
      4.1.3. CAI和/或DEX对肿瘤组织中TNF-α表达的影响  54-55
      4.1.4. CAI和/或DEX对肿瘤组织匀浆中TNF-α水平的影响  55-56
      4.1.5. CAI和/或DEX对肿瘤内巨噬细胞TNF-α mRNA表达的影响  56-57
      4.1.6. CAI和/或DEX对肿瘤组织中血管生成的影响  57-59
    4.2. CAI和/或DEX对裸鼠A549移植瘤模型的药效学评价和作用机制研究  59-63
      4.2.1. CAI和/或DEX对瘤重的影响  59-60
      4.2.2. CAI和/或DEX对肿瘤组织匀浆TNF-α和TGF-β水平的影响  60-61
      4.2.3. CAI和/或DEX对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α水平的影响  61-62
      4.2.4. CAI和/或DEX对移植瘤组织中血管生成的影响  62-63
  5. 小结  63-64
    5.1. 小鼠LLC移植瘤模型  63
    5.2. 裸鼠A549移植瘤模型  63-64
第三部分：羧胺三唑对肿瘤环境所诱导的巨噬细胞的影响  64-88
  1. 前言  64
  2. 实验材料  64-67
    2.1. 实验动物  64
    2.2. 细胞系  64
    2.3. 试剂及材料  64-67
      2.3.1. 一般药品  64
      2.3.2. 细胞培养材料  64-65
      2.3.3. 试剂盒  65-66
      2.3.4. 抗体  66
      2.3.5. 免疫组化染色材料  66
      2.3.6. 荧光定量RT-PCR材料  66-67
    2.4. 主要仪器  67
  3. 实验方法  67-74
    3.1. 常用溶液配制  67-69
    3.2. 肿瘤环境诱导的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞  69-72
      3.2.1. C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞的提取  69
      3.2.2. CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞增殖  69-70
      3.2.3. 与LLC细胞共培养的小鼠腹腔巨噬细胞p65免疫化学染色  70-71
      3.2.4. 细胞因子检测  71-72
    3.3. 肿瘤环境诱导的RAW264.7细胞  72-73
      3.3.1. CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞增殖  72
      3.3.2. 细胞因子检测  72
      3.3.3. 荧光定量RT-PCR  72-73
      3.3.4. 结晶紫染色  73
    3.4. 统计学方法  73-74
  4. 实验结果  74-87
    4.1. CAI和/或DEX对肿瘤环境诱导的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞的影响  74-80
      4.1.1. CAI和/或DEX对单独培养的LLC细胞增殖的影响  74-75
      4.1.2. 与LLC细胞共培养的小鼠腹腔巨噬细胞p65免疫化学染色  75
      4.1.3. CAI和/或DEX对LCM诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α,IL-6的影响  75-78
      4.1.4. CAI对LCM诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放IL-10的影响  78
      4.1.5. 小鼠腹腔巨噬细胞对LLC细胞增殖的影响  78-79
      4.1.6. CAI和/或DEX对共培养体系中LLC细胞增殖的影响  79-80
    4.2. CAI和/或DEX对肿瘤环境诱导的RAW264.7细胞的影响  80-87
      4.2.1. CAI对LCM诱导的RAW264.7细胞增殖的影响  80-81
      4.2.2. CAI和/或DEX对LCM诱导的RAW264.7细胞释放细胞因子的影响  81-83
      4.2.3. CAI和/或DEX对LCM诱导的RAW264.7细胞因子mRNA表达的影响  83-84
      4.2.4. 经CAI和/或DEX预处理的RAW264.7细胞对LLC细胞迁移的影响  84-86
      4.2.5. 经CAI和/或DEX预处理的RAW264.7细胞对LLC细胞侵袭的影响  86-87
  5. 小结  87-88
    5.1. CAI和/或DEX对肿瘤环境诱导的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞的影响  87
    5.2. CAI和/或DEX对肿瘤环境诱导的RAW264.7细胞的影响  87-88
讨论  88-99
  1. 目前对CAI抗炎作用的认识  88-90
  2. CAI对非特异性免疫及细胞免疫的影响  90-92
  3. CAI的抗肿瘤药效学评价  92-93
  4. CAI的抗肿瘤机制研究  93-96
  5. DEX对CAI的抗肿瘤增效作用  96-97
  6. 待解决问题及展望  97-99
结论  99-100
参考文献  100-108
文献综述：TNF-α在炎癌关系中的作用研究进展  108-122
  摘要  108
  1. TNF-α及其受体  108-109
  2. TNF-α及其受体的生物学效应  109
  3. TNF-α在炎症及自身免疫疾病中的作用  109-110
  4. TNF-α与炎～癌关系  110-114
    4.1. TNF-α与肿瘤的发生  111-112
    4.2. TNF-α与肿瘤的发展  112
    4.3. TNF-α促进肿瘤发生,发展的作用机制  112-114
  5. TNF-α与肿瘤的防治  114-115
  6. 总结与展望  115-116
  参考文献  116-122
致谢  122-124

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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