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黑索金和奥克托金的LC-MS/MS定性和定量方法研究及在大鼠体内的应用

作　者: 张茜
导　师: 刘丽宏
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 药理学
关键词: 黑索金 奥克托金 液相色谱串联质谱 体内分析 药物代谢动力学
分类号: R969.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：应用液相色谱串联质谱高通量平台,研究黑索金(RDX)和奥克托金(HMX)的质谱行为,并建立一种简单、快捷、灵敏度高的RDX和HMX体内同时定量的液相色谱串联质谱定量检测方法,并将其应用于大鼠血浆样本,用以验证定量分析方法的准确性,为临床硝胺化合物中毒的早期发现及救治提供方法支持。方法：取RDX或HMX(10μg·mL-1)的对照品溶液蠕动进样,进行Q1全扫描,再以各母离子为对象进行二级碎片离子扫描,根据母离子和二级碎片离子信息,推导各离子对归属,寻找RDX和HMX的质谱裂解规律。分别进行色谱条件优化、质谱条件优化、前处理方法摸索等步骤,建立定量分析方法,并进行全面的方法学验证。建立简易含硝胺化合物的大鼠模型,采集不同时间点的血浆样本,用建立的定量分析方法对血浆中RDX和HMX的含量进行测定。根据浓度-时间数据采用DAS2.0软件进行药动学参数计算,进行硝胺化合物在大鼠体内的代谢动力学评价；考察给药组及空白组血浆中肝脏肾脏ALT、ALP、AST指标变化；给药后8h大鼠颈椎脱臼处死,解剖取肝脏肾脏进行病理学组织考察。结果：RDX和HMX均与流动相中的杂质加合成[M+Cl]-、[M+HOCH2COO]-加合离子,它们的碎片离子主要是失去特征的NO2-、CH2NNO2-离子。RDX与硝胺碎片加合,形成[M+NO2-H]-、[M+CH2NNO-H]-和[M+N03]-加合离子,HMX与硝胺碎片加合成m/z377.0[M+C3H3N3]-离子,其子离子155.0[C3H3N3]-为HMX的结构鉴定提供有力证据。建立了一种快速、有效的同时定量检测大鼠血浆中RDX和HMX的LC-MS/MS定量分析方法。RDX、HMX和内标霉酚酸经过简单的蛋白沉淀前处理,用乙腈和水作为流动相在C18色谱柱上得到较好分离,洗脱时间仅为8min。应用ESI源负离子模式进行MRM扫描,RDX的定量离子对为m/z284.1→61.7,HMX的定量离子对为m/z331.0→108.8,内标的定量离子对为m/z319.2→m/z191.1.采用溶剂稀释标准溶液作为定量标准曲线,以未知样本测得浓度除以校准系数进行准确定量。RDX和HMX的定量范围均为5-200ng·nL-1。RDX的回收率为60.04±4.18%,HMX的回收率为79.57±3.35%。该方法的精密度与准确度均在±15%以内,满足定量分析的要求。血浆样本连续两次进样、室温放置4h、三次熔融和长期冻融下均稳定。用建立的LC-MS/MS定量检测方法对含硝胺化合物大鼠血浆样本进行定量检测,血浆中RDX的浓度由141.72ng·mL-1降至14.69ng·mL-1; HMX的浓度由30.39ng·mL-1降至1.24ng·mL-1,证明该定量方法能够应用于实际血浆样本分析。大鼠尾静脉注射0.5mL硝基胺类化合物混合水溶液后,RDX的t1/2为(324.68±188.91)min,Cmax为(127.50±28.39)ng·mL-1,AUC0-t为(24164.75±5401.43)ng·min·mL-1; HMX的t1/2为(134.88±100.01)min,Cmax为(26.78±7.82)ng·mL-1,AUC0-t为(3787.55±2587.03)ng·min·mL-1。给药后大鼠肠胀气,但肝脏肾脏组织均未见病理变化。试验结论：RDX和HMX均形成错综复杂的加合离子,质谱行为也有一定相似；[C3H3N3]-为HMX特有的离子,能够用于HMX的结构鉴定。建立同时测定大鼠血浆中RDX和HMX的LC-MS/MS方法,操作简单、快速、灵敏度高,能够应用于实际血浆样本中RDX和HMX的分析。RDX和HMX在血液中分布比例小,两者消除速率有显著性差异。注射硝胺化合物后大鼠肠胀气,但病理组织学无变化。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-15
缩略词表  15-16
前言  16-20
  1.1 硝胺化合物的概况  16-19
    1.1.1 硝胺化合物的性质  16-17
    1.1.2 常用的硝胺化合物定量分析方法  17-18
    1.1.3 硝胺化合物定量分析方法应用现状  18-19
  1.2 体内小分子分析方法及液相色谱-质谱联用分析技术  19
  1.3 研究目的及目标  19-20
2 试验部分  20-31
  2.1 试验目的  20
  2.2 试验材料  20-21
    2.2.1 仪器  20
    2.2.2 试验对照品  20
    2.2.3 试验试剂  20-21
    2.2.4 试验动物  21
    2.2.5 试验样本采集  21
      2.2.5.1 给药液的配制  21
      2.2.5.2 血浆样本采集  21
      2.2.5.3 肝肾组织样本采集  21
  2.3 质谱裂解规律研究  21-22
    2.3.1 试验溶液配制  21
    2.3.2 Q1全扫描  21-22
    2.3.3 二级碎片扫描  22
    2.3.4 质谱行为研究  22
  2.4 体内定量分析方法建立  22-27
    2.4.1 储备液的配制  22
    2.4.2 质谱条件摸索  22-24
      2.4.2.1 质谱参数优化  22-24
      2.4.2.2 离子源参数优化  24
    2.4.3 色谱条件摸索  24
      2.4.3.1 流动相的选择  24
      2.4.3.2 色谱柱的选择  24
      2.4.3.3 柱温的选择  24
    2.4.4 优选定量离子对  24
    2.4.5 前处理方法的选择  24-25
    2.4.6 内标的选择  25
    2.4.7 定量标准曲线的选择  25
    2.4.8 LC-MS/MS定量分析方法  25-27
  2.5 方法学验证  27-29
    2.5.1 方法学特异性和专属性  27
    2.5.2 标准曲线和定量限  27-28
    2.5.3 精密度与准确度  28
    2.5.4 提取回收率和基质效应  28
    2.5.5 稳定性  28-29
  2.6 药代动力学研究  29
    2.6.1 未知样本检测  29
    2.6.2 药代动力学评价  29
  2.7 病理学研究  29-30
    2.7.1 解剖观察病理变化  29
    2.7.2 肝肾指标检测  29
    2.7.3 肝肾病理组织学考察  29-30
      2.7.3.1 组织制片  29-30
      2.7.3.2 HE染色  30
      2.7.3.3 病理切片观察  30
  2.8 数据处理  30-31
3 试验结果  31-57
  3.1 质谱行为研究  31-34
    3.1.1 RDX质谱行为研究  31
    3.1.2 HMX质谱行为研究  31-34
  3.2 定量分析方法学验证  34-47
    3.2.1 方法学特异性和专属性  34-35
    3.2.2 标准曲线和定量限  35-37
    3.2.3 精密度与准确度  37-38
    3.2.4 提取回收率和基质效应  38
    3.2.5 稳定性  38-39
    3.2.6 结论  39-47
  3.3 定量方法应用  47-53
    3.3.1 未知样本检测结果  47
    3.3.2 药代动力学评价  47-53
      3.3.2.1 RDX药代动力学参数  47
      3.3.2.2 HMX药代动力学参数  47-53
  3.4 病理学考察  53-57
    3.4.1 解剖  53
    3.4.2 肝脏指标  53
    3.4.3 肝肾病理组织学  53-57
讨论  57-62
  4.1 质谱裂解规律  57
    4.1.1 离子化模式选择  57
    4.1.2 RDX和HMX质谱行为异同点  57
  4.2 LC-MS/MS定量分析方法建立  57-59
    4.2.1 LC-MS/MS条件优化  57-58
      4.2.1.1 流动相的选择  57-58
      4.2.1.2 色谱柱的选择  58
    4.2.2 样品的前处理方案  58-59
    4.2.3 内标的选择  59
  4.3 方法学验证  59-60
    4.3.1 标准曲线的选择  59
    4.3.2 稳定性考察  59
    4.3.3 提取回收率和基质效应  59-60
  4.4 方法学应用  60
  4.5 药代动力学评价  60-61
  4.6 病理学考察  61-62
    4.6.1 解剖观察  61
    4.6.2 肝脏指标考察  61
    4.6.3 肝肾病理组织学考察  61-62
结语  62-63
参考文献  63-70
附录  70-88
  附录1 综述  70-85
    参考文献  78-85
  附录2 研究生期间论文发表情况  85-87
  附录3 研究生期间获奖情况  87-88
致谢  88

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 临床药理学 > 药物代谢动力学
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