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姜黄素微生物转化产物的研究

作　者: 张维宇
导　师: 王普
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 姜黄素 微生物转化 菌种筛选 四氢姜黄素 六氢姜黄素
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


姜黄素(Curcumin)是一种多酚类化合物,具有广泛的生物活性。由于姜黄素存在水溶性差、结构不稳定、生物利用度低等问题,使其在食品和医药领域中的应用受到一定的限制。通过微生物转化法对姜黄素进行结构修饰是解决上述问题的有效途径之一。利用微生物细胞中含有的功能和性质各异的相关酶系,可有效转化姜黄素底物合成含有不同取代基,且性能优于姜黄素的系列衍生物。本论文针对微生物转化制备姜黄素衍生物进行了优良转化菌株的筛选及菌种鉴定；转化产物的分离纯化及结构解析；转化菌株发酵培养基的优化；以及静息细胞转化过程条件优化等,为今后研发性能更优的姜黄素类药物奠定良好的基础。首先,从土壤中筛选得到了对姜黄素具有较好转化能力的菌株ZJPH0802。通过形态学、生理生化特征,并结合分子鉴定,该菌株被鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) ZJPH0802。通过TLC和HPLC法检测,该菌株转化姜黄素后形成两个主要的转化产物。其中,转化产物Ⅰ的Rf值为0.424,保留时间为26min,转化产物Ⅱ的Rf值为0.712,保留时间为62min。利用硅胶柱层析和制备薄层层析法对Pichia kudriavzevii ZJPH0802的批量转化液进行分离纯化,制备得到产物Ⅰ0.005g,产物Ⅱ0.008g,经HPLC法检测,两者的纯度均大于95%。UV检测显示,在200～500nm范围内,产物Ⅰ和产物Ⅱ的最大吸收波长均为280nm。LC-MS检测结果表明,产物Ⅰ的分子量为374,根据分子量和碎片峰的信息初步推断产物Ⅰ为六氢姜黄素；产物Ⅱ的分子量为372,根据分子量和碎片峰的信息初步推断其为四氢姜黄素。最后经1H-NMR进一步证实了推测结果。继而,以六氢姜黄素产率为优化目标,对Pichia kudriavzevii ZJPH0802的发酵培养基组成和静息细胞转化条件进行了优化,确定最佳培养基组成为：甘油50g/L；蛋白胨5g/L;MgSO4·7H2O0.4g/L; KH2PO40.2g/L;K2HPO40.2g/L;最佳转化工艺条件为：pH6.5；静息细胞浓度50g/L；底物姜黄素浓度50mg/L；转化40h。通过对发酵培养基组成和转化条件的优化,六氢姜黄素的产率由优化前的11.91%提高到47.89%,为优化前的4.0倍。最后,以四氢姜黄素产率为优化目标,对Pichia kudriavzevii ZJPH0802的发酵培养基组成和静息细胞转化条件也进行了优化,得到最优的培养基组成为：葡萄糖25g/L；酵母膏2.5g/L;NH4C16.5g/L;MgSO4·7H2O0.5g/L;KH2PO41.0g/L;K2HPO41.0g/L。确定最佳的转化条件为：pH6.5；最佳静息细胞浓度80g/L；转化过程中加入无水乙醇作为底物溶媒；姜黄素浓度50mg/L;转化时间为24h。通过转化工艺的优化,四氢姜黄素产率从优化前的64.05%增加到77.43%,为优化前的1.2倍。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-15
第一章 文献综述  15-26
  1.1 微生物转化的研究概况  15
  1.2 天然活性成分的微生物转化的研究概况  15-20
    1.2.1 概述  15-16
    1.2.2 天然活性成分的微生物转化途径  16
    1.2.3 微生物转化在天然产物合成中的应用  16-20
  1.3 姜黄素研究进展  20-24
    1.3.1 姜黄素简介  20
    1.3.2 姜黄素的化学结构  20-21
    1.3.3 姜黄素的生物活性研究  21-22
    1.3.4 姜黄素的微生物转化研究  22-24
  1.4 论文思路  24-26
第二章 材料与方法  26-30
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 菌种  26
    2.1.2 培养基  26
    2.1.3 主要试剂  26-27
    2.1.4 主要仪器和设备  27
  2.2 实验方法  27-30
    2.2.1 菌体培养和收集方法  28
    2.2.2 生物转化制备姜黄素衍生物的转化过程  28
    2.2.3 分析检测方法  28-29
    2.2.4 姜黄素衍生物的制备方法  29
    2.2.5 菌株ZJPH0802的培养基优化  29
    2.2.6 菌株ZJPH0802转化条件优化  29-30
第三章 微生物转化制备姜黄素衍生物的菌种选育及鉴定  30-42
  3.1 引言  30-31
  3.2 实验材料  31
    3.2.1 土样  31
    3.2.2 培养基  31
    3.2.3 主要试剂  31
  3.3 实验方法  31-33
    3.3.1 菌种筛选  31-32
    3.3.2 菌种培养方法  32
    3.3.3 生物转化制备姜黄素衍生物过程  32
    3.3.4 分析检测方法  32
    3.3.5 菌种鉴定  32-33
  3.4 结果与讨论  33-41
    3.4.1 菌种筛选  33-36
    3.4.2 菌株ZJPH0802的鉴定  36-38
    3.4.3 菌株ZJPH0802的生长曲线  38-39
    3.4.4 菌株ZJPH0802的菌体湿重-干重标准曲线  39-40
    3.4.5 菌株ZJPH0802菌体浓度的测定及其标准曲线  40-41
  3.5 本章小结  41-42
第四章 姜黄素微生物转化产物的分离纯化与结构鉴定  42-52
  4.1 引言  42
  4.2 主要材料  42-43
  4.3 主要仪器  43
  4.4 实验方法  43-44
    4.4.1 硅胶柱层析法分离制备姜黄素微生物转化产物  43
    4.4.2 姜黄素微生物转化产物的分离纯化  43
    4.4.3 姜黄素微生物转化产物的鉴定  43-44
  4.5 结果与讨论  44-50
    4.5.1 硅胶柱层析法分离制备姜黄素微生物转化产物  44
    4.5.2 姜黄素微生物转化产物的鉴定  44-50
  4.6 本章小结  50-52
第五章 微生物转化制备六氢姜黄素的培养基优化和静息细胞转化过程优化  52-64
  5.1 引言  52-53
  5.2 实验材料  53
    5.2.1 菌株  53
    5.2.2 培养基  53
    5.2.3 主要试剂  53
    5.2.4 主要仪器和设备  53
  5.3 实验方法  53-54
    5.3.1 菌体培养和收集方法  53
    5.3.2 生物转化制备姜黄素衍生物的转化过程  53
    5.3.3 液相色谱条件  53
    5.3.4 转化产物六氢姜黄素标准曲线  53-54
    5.3.5 转化产物产率的计算  54
  5.4 结果与讨论  54-63
    5.4.1 发酵培养基中碳源的确定  54-55
    5.4.2 甘油浓度对六氢姜黄素产率的影响  55-56
    5.4.3 发酵培养基中氮源的确定  56-57
    5.4.4 蛋白胨浓度对六氢姜黄素产率的影响  57
    5.4.5 金属离子种类对六氢姜黄素产率的影响  57-58
    5.4.6 MgSO_4·7H_2O浓度对六氢姜黄素产率的影响  58-59
    5.4.7 KH_2PO_4+K_2HPO_4浓度对六氢姜黄素产率的影响  59-60
    5.4.8 缓冲液pH值对六氢姜黄素产率的影响  60
    5.4.9 细胞浓度对六氢姜黄素产率的影响  60-61
    5.4.10 底物浓度对六氢姜黄素产率的影响  61-62
    5.4.11 转化反应过程曲线  62-63
  5.5 本章小结  63-64
第六章 微生物转化制备四氢姜黄素的培养基优化和静息细胞转化过程的优化  64-72
  6.1 引言  64
  6.2 实验材料  64-65
    6.2.1 菌种  64
    6.2.2 培养基  64-65
    6.2.3 主要试剂  65
    6.2.4 主要仪器和设备  65
  6.3 实验方法  65-66
    6.3.1 菌体培养和收集方法  65
    6.3.2 生物转化制备姜黄素衍生物的转化过程  65
    6.3.3 液相色谱条件  65
    6.3.4 转化产物四氢姜黄素标准曲线  65-66
    6.3.5 转化产物产率的计算  66
  6.4 结果与讨论  66-71
    6.4.1 发酵培养基配方的正交优化  66-68
    6.4.2 缓冲液pH对四氢姜黄素产率的影响  68
    6.4.3 底物溶媒对四氢姜黄素产率的影响  68-69
    6.4.4 底物浓度对四氢姜黄素产率的影响  69-70
    6.4.5 静息细胞浓度对四氢姜黄素产率的影响  70
    6.4.6 转化发应时间对四氢姜黄素产率的影响  70-71
  6.5 本章小结  71-72
第七章 结论与建议  72-75
  7.1 结论  72-73
    7.1.1 微生物转化制备姜黄素衍生物的菌种选育及鉴定  72
    7.1.2 姜黄素微生物转化产物的分离纯化与结构鉴定  72-73
    7.1.3 微生物转化制备六氢姜黄素的培养基优化和静息细胞转化过程的优化  73
    7.1.4 微生物转化制备四氢姜黄素的培养基优化和静息细胞转化过程的优化  73
  7.2 今后工作的建议  73-75
参考文献  75-82
附图  82-84
攻读硕士学位期间发表论文和申请专利情况  84-85
致谢  85-86

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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