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毛囊重建体内模型构建的实验研究

作　者: 肖顺娥
导　师: 胡志奇
学　校: 南方医科大学
专　业: 整形外科学
关键词: 细胞移植毛囊重建小室法毛囊毛乳头细胞
分类号: R758.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：毛囊的形态发生是上皮与真皮细胞间相互作用的结果。上皮中的多能干细胞和真皮中的毛乳头细胞是毛囊形态发生中不可或缺的成分,但这两者间通过何种机制发生作用,有哪些信号、因子参与目前尚不完全清楚。体外构建功能完整的毛囊比较困难,因为它需要比较复杂的三维空间结构。毛囊重建的体外模型已从单层毛囊细胞的培养演变到用毛囊细胞三维构建含有毛囊的人造皮肤。虽然,这对毛囊组织工程研究具有一定价值,但是,体外毛囊模型的构建在回答一些有关毛囊发育信号通道和毛发周期调控复杂的问题上存在一定的缺陷。在体内,毛囊除通过血管供应营养物质和氧气外,也通过旁分泌机制接受来自邻近细胞的信号分子,如生长因子、细胞因子的调节。而体外毛囊的重建由于营养物质、氧气、信号分子的缺失或者减少并不能完全模型体内毛囊发育过程。因此,建立适宜的体内毛囊发育模型用以研究毛囊形态发生及周期循环分子机制非常重要。毛囊细胞移植是治疗秃发的一种实验性细胞疗法,以获取增殖能力强并且具有毛囊诱导能力的毛乳头细胞为前提。但是,毛乳头细胞经体外培养扩增后其诱导能力会逐渐丧失。目前,与毛乳头细胞诱导能力相关的明确的细胞表面标志尚未得到识别,也没有简便的体外实验用以检测毛乳头细胞的毛发诱导能力。因此,建立一个简便、可靠,并能够直接检测毛乳头细胞诱导能力的动物模型也很有必要。目前,有多种毛囊重建体内模型。小室法,最早由Lichti和Weinberg介绍使用,Lichiti在2008年又对此模型进行了改进,是已确定的可用于毛囊重建研究的模型之一。另外一种模型是注射法,最先由Morris介绍使用,后来Zheng对此模型进行了改善。注射法是将上皮和真皮细胞的混合物注射至真皮内重建毛囊。三明治法最先由Reynolds和Jahoda介绍使用,是将毛乳头细胞插在供体大鼠足垫皮肤的上皮与真皮之间,然后将复合物移植至受体鼠皮肤创区。皮瓣法是近来发展的,是在裸鼠背部置于一块硅胶板,将上皮薄片平铺在硅胶板上,然后将真皮细胞移植至上皮薄片上,最后将裸鼠背部皮瓣覆盖缝合。每种毛囊重建体内模型均有其适用情况,小室法具有较好的重复性,被广泛应用。上皮与真皮细胞被移植到小室后两者能够密切接触,为毛囊的重建提供了适宜的空间和环境,并排除了受体自身细胞的干预。移植后3周移植部位有新的毛发长出,毛发质量、密度与正常毛发相似,这为毛囊重建的评估提供了最直接的证据。实验中,我们构建了小室法毛囊发育模型,并探讨了上皮与真皮细胞何者在毛囊重建中起主导作用。但是,小室法仍存在一些缺陷,如对动物创伤太大；皮肤创面容易感染随后动物死亡；需要大量的细胞(大约需1×107上皮细胞+1×107真皮细胞)；一只动物只能做一个小室移植。这将一定程度上影响毛囊重建的成功率。另外,一些很难获取的或者经过特殊处理的细胞用小室法移植,实验难度与实验耗费会明显增加。因此,我们尝试使用微型小室进行细胞移植,以期改善上述不足。毛乳头细胞是毛囊重建中不可或缺的真皮成分。目前,国内外学者主要通过显微解剖法和酶消化法分离获取鼠触须毛囊和人头皮毛囊中的毛乳头细胞,其工作难度大,获取率低。在毛囊重建的研究中,迫切需要一种简便的方法来获取大量的具有诱导能力的毛乳头细胞。出生后1d内的C57小鼠背部皮肤中毛囊大部分处于形态发生第4阶段之前,真皮中含有的大量的具有诱导能力的毛乳头细胞。将新生鼠真皮细胞经体外培养扩增这为毛乳头细胞的来源提供了一种理论可行的途径。我们用培养的真皮细胞与新鲜的上皮细胞一起移植,以探讨培养的真皮细胞用于毛囊重建的可行性。目的：(1)构建小室法毛囊重建模型(2)构建微型小室法毛囊重建模型(3)探讨培养的新生鼠真皮细胞用于毛囊重建的可行性方法：(1)新生鼠皮肤细胞以小室法移植构建毛囊发育模型取新出生1d内的C57BL/6近交系小鼠背部皮肤,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗后,用显微镊将表皮和真皮分离并分别剪碎,分别用0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基,分别调整细胞浓度为1×107个/ml。取真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(1×107个)用200μl高糖培养基(不含FBS)重悬后备用。同时,调整真皮细胞与表皮细胞不同的比例,分别为真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(5×106个)、真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(1×106个)、真皮细胞(1×107个)、真皮细胞(5×106个)+表皮细胞(1×107个)、真皮细胞(1×106个)+表皮细胞(1×107个)、表皮细胞(1×107个),分别用200μ1高糖培养基重悬后备用。用5m1离心管的盖子制备成小室。取5m1离心管,将盖子剪下并将其中央部分去掉,在盖子下端贴一层扎有多个小孔的纸胶布,高压消毒后备用。受体裸鼠予腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml)麻醉后,以安尔碘消毒背部皮肤3遍,剪刀剪下1块圆形皮肤,深达肉膜,直径为小室直径的一半。把制备好的小室插入到皮肤与肉膜之间,上端暴露于空气中,将盖子周边松弛皮肤缝合固定,形成一个可以容纳细胞悬液的开放小室。将细胞混悬液注射至小室内,3d后在小室顶部中央剪孔以促使创面干燥,1周后拆去小室。分别于细胞移植后1、2、3、4周大体观察移植部位毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后移植部位取材,10%甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,镜下观察。细胞移植4周后将移植部位的毛发全部拔除,观察毛发再生情况。(2)新生鼠皮肤细胞以微型小室法移植构建毛囊发育模型取出生后1d内C57BL/6J小鼠背部皮肤,并剪成0.5cm×0.5cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗3次后,将其表皮和真皮分离,真皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬。将新出生1d内的绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠背部皮肤剪成0.5cm×0.5cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜后将其表皮和真皮分离,表皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶消化37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。细胞加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬。配制DiI储存液：取5mg Dil避光、37℃溶于20μl DMSO,-20℃冻存。取1μl DiI储存液加入300μl PBS稀释后以3000r/min离心5min,真皮细胞悬液以1000r/min离心5min后弃掉上清液加入200μl DiI染液,混匀,染色5-7min后加入PBS清洗并低速离心,细胞沉淀加入DMEM重悬并调制细胞浓度为1x106个/ml备用。将直径为2.5mm的硅胶管制备成微型小室,高压消毒后备用。裸鼠腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml)麻醉成功后,安尔碘消毒背部皮肤3次,在背部剪下直径为2mm的圆形皮肤,深达肉膜。把制备好的微型小室插入皮下与肉膜间,上端暴露于空气中,将小室周边荷包缝合一圈,防止小室脱落,每只裸鼠移植4个微型小室。细胞以以下组合用20μ1高糖培养基重悬后分别注射至微型小室内,1周后拆去小室。(ⅰ)真皮细胞(5x106个)+表皮细胞(5×106个)；(ⅱ)真皮细胞(2×106个)+表皮细胞(2×106个)；(ⅲ)真皮细胞(1×106个)+表皮细胞(1×106个)；(ⅳ)真皮细胞(5×105个)+表皮细胞(5×105个)；(ⅴ)真皮细胞(1×105个)+表皮细胞(1×105个)；(ⅵ)真皮细胞(5×104个)+表皮细胞(5×104个)。另外,分别用DiI标记的真皮细胞(5×105个)+未标记的表皮细胞(5×105个)；GFP转基因小鼠的表皮细胞(5×105个)+未标记的真皮细胞(5×105个)用微型小室移植。细胞移植后1、2、3、4周,大体观察移植部位毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后,移植部位取材,石蜡切片HE染色、冷冻切片荧光检测和扫描电镜观察。将移植部位的毛发用镊子直接全部拔除,观察毛发再生情况。(3)培养的新生鼠真皮细胞与新鲜上皮细胞移植取出生后1d内C57BL/6J小鼠背部皮肤,并剪成0.5cm×0.5cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗3次后,显微镊将其真皮和表皮分离,真皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤,以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬,台盼蓝染色法检测细胞存活率。调整细胞浓度为1×106个/ml,取1ml细胞悬液接种至10cm培养皿中并加入6m1培养基,置于孵箱中培养,24h换液。细胞长至80%融合时传代培养。表皮用0.25%胰蛋白酶于37℃消化10min,表皮细胞的制备过程与真皮细胞相似。将27只受体裸鼠随机分为4组,每只裸鼠背部移植4个微型小室。细胞以以下组合重悬于20μ1高糖培养基后移植至微型小室内(表皮细胞5×106个；真皮细胞5×106个)。新鲜上皮细胞+新鲜真皮细胞(组1)；新鲜上皮细胞+P0真皮细胞(培养3d,组2)；新鲜上皮细胞+P1真皮细胞(组3)；新鲜上皮细胞+P0真皮细胞(培养过夜,组4)。1周后拆去微型小室。移植后(1、2、3、4周)大体观察毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后移植部位取材,10%甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,显微镜下观察。结果：(1)新生鼠皮肤细胞以小室法移植后结果细胞移植后1周,创面湿润无明显收缩,中央形成淡红色半透明组织。细胞移植后2周,创面完全愈合。细胞移植后3周,移植部位有黑色毛发长出皮肤。细胞移植后4周,浓密黑色毛发垂直于皮肤表面生长,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整。将移植部位毛发拔除后1周能够再生出新的毛发。将细胞以不同的比例移植,真皮细胞数量为1×107而表皮细胞数量降至1×106时,毛囊重构的效率并无明显改变。表皮细胞数量为1×107而真皮细胞数量降至5×106或者更少时,再生毛发的数量明显减少,两者单独移植均无毛发生长。移植部位的毛发拔除后,毛囊能再生出毛发并在3w内达到原来的长度。(2)新生鼠皮肤细胞以微型小室法移植后结果细胞移植4周后可见移植部位有大量黑色毛发垂直皮肤表面生长。移植的细胞数量改变时,毛囊重建的效果也随之改变。当移植的上皮与真皮细胞数量分别由5×106降低至2×106时,毛囊重建的效果并无明显改变。但当上皮与真皮分别降低至5×104时,移植部位无毛发生长,仅有黑色色素沉着。毛发生长部位取材,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整,电镜扫描见毛发生长方向规整,毛发质量优异与正常毛发无明显差异。冷冻切片荧光检测见毛囊毛乳头部位为红色荧光,毛囊上皮成分为绿色荧光。重建的毛囊能维持至少6个月,毛发被拔除后毛囊能够再生出新的毛发。(3)培养的新生鼠真皮细胞与新鲜上皮细胞移植后结果新鲜上皮细胞与培养的真皮细胞移植后,组2(新鲜上皮细胞+P0真皮细胞,培养3d)；组3(新鲜上皮细胞+P1真皮细胞)移植部位均未见毛发生长,仅有黑色色素沉着。移植部位组织学观察未见毛囊形成。组4(新鲜上皮细胞+培养过夜的真皮细胞)移植部位可见浓密黑色毛发长出,与组1(新鲜上皮细胞+新鲜真皮细胞)长出的浓密黑色毛发外观无明显差异。移植部位组织学观察见毛囊结构发育完整。结论：(1)新生鼠皮肤细胞以小室法移植后可以构建毛囊发育的完整模型,此模型可用于检测毛囊细胞的毛发诱导能力,以及研究毛囊形态发生和周期循环的分子机制。(2)微型小室法毛囊重建模型具有所需细胞量少、创伤小、并发症少、毛囊重建成功率高的优点,是一种可靠、实用的毛囊重建模型。尤其是所需细胞量少,一只动物可以做多个部位移植,可以明显降低实验难度和实验耗费。(3)新生鼠真皮细胞经培养过夜后,既排除了上皮角质细胞的污染,同时又保留了真皮中具有诱导能力的毛乳头细胞,可用于毛囊重建实验研究。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-22
第一章新生鼠皮肤细胞以小室法移植后构建毛囊发育模型  22-37
  前言  22-24
  1 材料和方法  24-25
  2 结果  25-31
  3 讨论  31-33
  4 结论  33
  5 参考文献  33-37
第二章新生鼠皮肤细胞以微型小室法移植后构建毛囊发育模型  37-52
  前言  37-40
  1 材料和方法  40-42
  2 结果  42-47
  3 讨论  47-48
  4 结论  48
  5 参考文献  48-52
第三章培养的新生鼠真皮细胞用于毛囊重建的实验研究  52-64
  前言  52-53
  1 材料和方法  53-54
  2 结果  54-58
  3 讨论  58-60
  4 结论  60
  5 参考文献  60-64
综述  64-78
  参考文献  72-78
缩略词对照表  78-79
攻读硕士学位期间的成果  79-80
致谢  80-81

毛囊重建体内模型构建的实验研究

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