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运用CALI技术研究中间纺锤体的组装对胞质分裂和有丝分裂退出事件的调控功能

作　者: 孟凡力
导　师: 李朝军
学　校: 南京师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: CALI 中间纺锤体胞质分裂有丝分裂退出周期蛋白B3
分类号: Q253
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细胞有丝分裂中,姐妹染色单体分离完成后的阶段叫做胞质分裂。在姐妹染色单体分离的过程中,后期和末期的纺锤体微管(MTs)的一束组装形成反向平行的网络结构,这种反向平行微管结构称为中间纺锤体(central spindle)。动物细胞中间纺锤体分布有众多的调控蛋白质,在胞质分裂中具有多种功能：它不仅帮助决定了分裂沟的位点,也控制了分裂沟的内移和细胞膜在该处的沉积。不正常的纺锤体组装会直接导致染色体的分离错误或失败,造成遗传的不稳定性；胞质分裂的任何异常都会导致细胞分裂不能正常完成,最终可形成多核细胞以至细胞突变成癌细胞。据本课题的前期研究统计,人宫颈癌细胞能够自发形成染色体桥,我们通过共聚焦显微观察发现,带有染色体桥的中间纺锤体微管密度比正常无染色体桥的中间纺锤体微管密度薄弱。由于细胞染色体桥的出现能够诱导分裂沟退行性变化和胞质间桥断裂的失败,这提示我们,中间纺锤体微管结构的缺陷可能会影响胞质分裂进程和有丝分裂的退出。由于在很长时间内,人们对胞质分裂的研究仅停留在静态形态学观察上,而近些年随着细胞生物学和分子生物学等现代生物学科相关技术的飞速发展,对低等生物(如酵母、果蝇等)细胞胞质分裂的分子机理才有了比较深入的认识。到目前为止,在哺乳动物细胞中,人们对中间纺锤体微管和胞质分裂的动态调控,以及对有丝分裂退出的机制仍存在许多未知。本课题将针对以下问题进行深入研究：(1)破坏中间纺锤体是否影响胞质分裂进程?中间纺锤体微管的组装调控分裂沟的定位和起始功能的作用时间具体发生在什么时期?(2)中间纺锤体微管的组装是否调控细胞末期有丝分裂退出事件?如果是,那么人为破坏中间纺锤体微管是否对染色体解凝缩和核膜重构产生影响?其分子机制是什么?由于动物细胞胞质分裂过程十分短暂而迅速,为研究中间纺锤体组装和胞质分裂的动态调控机制带来了一定的困难。在本课题中,我们引进了发色基团辅助激光灭活(Chromophore-assisted laser inactivation, CALI)技术,能够快速实时特异性的灭活目的蛋白,解决了研究细胞精细结构的时空限制。我们利用该技术的这种特点,选择在特定时空破坏中间纺锤体微管,研究了中间纺锤体微管骨架的动态组装对胞质分裂和有丝分裂退出的影响。我们的研究发现：(1)后期B灭活中间纺锤体微管可导致胞质分裂速度减慢和末期染色体解凝缩受阻；后期A灭活中间纺锤体微管可导致调控分裂沟内移的关键因子RhoA在细胞皮质中区收缩环的定位失败,最终导致胞质分裂进程受阻。该实验结果表明,中间纺锤微管的组装调控分裂沟定位和收缩环起始的确切时间发生在后期A,破坏中间纺锤微管可影响胞质分裂进程。(2)中间纺锤体组装的完整性对细胞末期染色体解凝缩和核膜重建等有丝分裂的退出事件的发生是必须的。破坏中间纺锤体微管的组装,可引起调节染色体解凝缩的关键因子AuroraB-INCENP的定位紊乱,导致染色体无法解凝缩；破坏中间纺锤体结构导致CyclinB3的降解延迟,引起有丝分裂退出事件受阻。这表明,中间纺锤体结构的完整性对于末期有丝分裂退出起到重要的检验点作用,我们推测调控该检验点的关键分子机制是APCCdhl在后期能否顺利取代APCCdc20。而行使其他蛋白降解的功能。研究胞质分裂和有丝分裂的退出具有重要的理论和应用意义,它不仅揭示了细胞增殖和生命延续的奥秘,同时也为认识细胞分裂相关疾病(如癌症)的发病机理、药物设计和疾病治疗等提供理论依据。

全文目录

摘要 3-5Abstract 5-10第1章绪论 10-24 1.1 中间纺锤体组装研究进展 10-19 1.1.1 中间纺锤体的稳定性和自主装 10-11 1.1.2 调控中间纺锤体组装的微管相关蛋白MAPs 11-12 1.1.3 其他的中间纺锤体微管相关蛋白和马达蛋白 12-13 1.1.4 中间纺锤体各组件之间复杂的相互调节关系 13-15 1.1.5 中间纺锤体的组装受到时间和空间的调控 15-16 1.1.6 胞质分裂中收缩环的形成机制 16 1.1.7 肌球蛋白Ⅱ的活化调控肌动蛋白-肌球蛋白环的收缩 16-18 1.1.8 中间纺锤体和收缩环的协同关系 18-19 1.2 有丝分裂退出的研究进展 19-21 1.2.1 APC~(cdc20)触发有丝分裂的最终事件 19 1.2.2 细胞周期中APC受到多个层次的严密调控 19-20 1.2.3 有丝分裂后半段APC~(Cdhl)的激活 20-21 1.2.4 有丝分裂末期的主要事件 21 1.3 CALI实验技术进展 21-24 1.3.1 CALI技术简介 21-22 1.3.2 CALI技术在细胞生物学领域的应用进展 22 1.3.3 CALI灭活靶蛋白的光化学分子机制 22-24第2章染色体桥导致中间纺锤体缺陷 24-29 2.1 材料与方法 24-25 2.1.1 细胞培养 24 2.1.2 免疫荧光 24-25 2.1.3 细胞松弛素诱导三极细胞 25 2.1.4 激光共聚焦显微镜观察 25 2.2 实验结果与分析 25-27 2.2.1 具有染色体桥的细胞内中间纺锤体微管荧光强度较弱 25 2.2.2 三极细胞内染色体桥侧中间纺锤体微管结构出现缺陷 25-27 2.3 讨论 27-29第3章中间纺锤体的组装调控分裂沟形成和末期核膜重构事件 29-43 3.1 材料与方法 29-31 3.1.1 细胞培养 29 3.1.2 活细胞观察 29 3.1.3 CALI激光灭活实验 29-30 3.1.4 CALI处理网格玻片定位单细胞及跟踪免疫荧光实验流程 30 3.1.5 DNA活体染色 30 3.1.6 免疫荧光 30-31 3.1.7 激光共聚焦显微镜观察 31 3.2 实验结果与分析 31-40 3.2.1 CALI激光灭活系统的稳定性和专一性检测 31-33 3.2.2 中间纺锤体微管骨架在胞质分裂进程中的动态变化 33-34 3.2.3 后期B破坏中间纺锤体组装导致胞质分裂速度减慢 34-35 3.2.4 后期A破坏中间纺锤体组装造成细胞周期后期阻滞 35-37 3.2.5 中间纺锤体微管骨架参与调控分裂沟内移速度 37-39 3.2.6 中间纺锤体结构的完整性对核膜重建事件的发生是必须的 39-40 3.3 讨论 40-43第4章中间纺锤体的组装调控胞质分裂和有丝分裂退出的分子机制 43-57 4.1 材料与方法 44-46 4.1.1 细胞培养 44 4.1.2 免疫荧光 44 4.1.3 CALI处理网格玻片定位单细胞及跟踪免疫荧光实验流程 44 4.1.4 脱氧胸苷双阻断法细胞周期同步化和siRNA转染实验流程 44-45 4.1.5 激光共聚焦显微镜观察 45 4.1.6 免疫印记分析 45-46 4.2 实验结果与分析 46-54 4.2.1 后期A破坏中间纺锤体结构的组装导致RhoA定位紊乱 46-47 4.2.2 中间纺锤体结构的完整性和CyclinB1没有直接关系 47-49 4.2.3 后期破坏中间纺锤体结构的组装导致周期蛋白B3延迟降解 49-51 4.2.4 后期破坏中间纺锤体结构可引起AuroraB和INCENP定位紊乱,导致染色体无法解凝缩 51-54 4.3 讨论 54-57全文小结 57-58参考文献 58-67附录一实验仪器 67-68附录二主要试剂配方 68-69附录三主要试剂及材料 69-70在读期间发表的学术论文及研究成果 70-71致谢 71

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