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干细胞因子OCT4与乳腺癌侵袭的关系以及对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

作　者: 任静文
导　师: 单保恩；艾军
学　校: 河北医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 乳腺癌 OCT4 上皮间质转化 MDA-MB-231细胞干扰shRNA
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，乳腺癌细胞的侵袭转移是危及乳腺癌患者生命的重要因素。上皮间质转化（EMT）使乳腺癌细胞失去上皮标志，获得间质表型，表现出极强的侵袭、迁移能力，导致肿瘤转移，并且促使转移肿瘤细胞干细胞化，产生对化疗药物的抵抗。E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）分别表达于上皮细胞、间质细胞，是发生EMT的标志。研究表明，OCT4是诱导干细胞的一个关键转录因子，与维持肿瘤干细胞的自我更新能力和分化潜能性有关，参与了许多类型肿瘤细胞增殖和凋亡的调控。然而，关于OCT4对肿瘤侵袭转移的影响还研究甚少。本实验主要研究EMT相关因子E-cadherin和vimentin以及干细胞因子OCT4在乳腺癌中的表达，以此来探讨EMT与乳腺癌干细胞之间的相关性，并进一步通过RNA干扰技术下调乳腺癌细胞中OCT4的表达，并研究OCT4表达降低对乳腺癌细胞侵袭、转移、增殖和凋亡的影响。方法：1利用实时荧光定量PCR方法检测肿瘤干细胞标记物OCT4、EMT相关因子E-cadherin和vimentin mRNA在浸润性乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平；2利用免疫组织化学方法检测OCT4以及E-cadherin和vimentin在浸润性乳腺癌组织中蛋白水平的表达，并分析其表达与临床病理特征及预后的关系；3用三质粒系统包装293T细胞，产生慢病毒，感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，同时用control-shRNA-pLKO.3做阴性对照，感染72h后收集细胞检测；4利用荧光显微镜和流式细胞术检测control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3在MDA-MB-231细胞中的感染效率；5利用实时荧光定量PCR和Western blot法鉴定病毒感染MDA-MB-231细胞后，下调OCT4的效果；6利用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测下调MDA-MB-231细胞OCT4的表达后对EMT标志性分子E-cadherin和vimentin mRNA和蛋白表达水平的影响；7利用Transwell小室做侵袭和迁移实验检测下调MDA-MB-231细胞OCT4的表达后，对细胞侵袭和迁移能力的影响；8利用克隆形成实验检测下调MDA-MB-231细胞OCT4表达后，克隆形成能力的影响；9采用流式细胞术检测下调MDA-MB-231细胞OCT4表达后，细胞凋亡率和细胞周期分布情况。结果：1实时荧光定量PCR分析结果显示，在40例浸润性乳腺癌组织中，干细胞因子OCT4的mRNA表达与上皮标志物E-cadherin的mRNA表达成负相关（R=0.119，P＜0.05），与间质标志物vimentin的mRNA表达成正相关（R=0.245，P＜0.05），而E-cadherin mRNA表达与vimentin mRNA表达也呈负相关（R=0.227，P＜0.05）。2免疫组织化学分析结果显示，40例浸润性乳腺癌组织中，OCT4阳性率为30%（12/40），E-cadherin阳性率为55%（22/40），vimentin阳性率为65%（26/40）。OCT4表达与乳腺癌患者的年龄、组织学分级、淋巴结转移以及Her-2的表达有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin表达与淋巴结转移有关，差异具有统计学意义（P＜0.05），vimentin表达与组织学分级、淋巴结转移有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。OCT4表达与E-cadherin表达呈负相关（R=0.395，P＜0.05），与vimentin表达呈正相关（R=0.366，P＜0.05），而E-cadherin表达与vimentin表达也呈负相关（R=0.453，P＜0.05）。OCT4在转移性乳腺癌与未转移性乳腺癌之间的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。E-cadherin、vimentin在转移性乳腺癌和未转移的乳腺癌中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。生存分析结果显示，OCT4阳性表达患者的生存率明显低于阴性表达患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而E-cadherin和vimentin的表达与患者生存率之间未见明显相关性（P＞0.05）。3荧光显微镜观察病毒液感染效果，如Fig.1所示。流式细胞术检测病毒感染效率结果显示，100μl病毒液感染293T细胞时，control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的感染效率分别为22.6%、20.8%。200μl病毒液感染293T细胞时，control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的转染效率分别为54.9%、41.6%。500μl病毒液感染MDA-MB-231细胞， control-shRNA-pLKO.3和OCT4-shRNA-pLKO.3的转染效率分别为98.4%、86.1%。4实时荧光定量PCR、Western Blot分析结果显示，MDA-MB-231细胞中，感染OCT4-shRNA组的OCT4mRNA和蛋白表达水平明显低于parental组和control-shRNA组（P＜0.05）。同时检测下调OCT4基因表达后，EMT相关因子mRNA或蛋白的表达情况，分析结果显示，上皮标志物E-cadherin的mRNA和蛋白表达显著上调（P＜0.05），而间质标志物vimentin的表达显著下调（P＜0.05）。5Transwell分析结果显示，在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，感染OCT4-shRNA组迁移和侵袭到下室的细胞数明显少于parental组和control-shRNA组（P＜0.05），说明下调OCT4基因表达明显抑制了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。6克隆形成实验结果显示，下调OCT4基因表达后，MDA-MB-231细胞中，parental组、control-shRNA组和OCT4-shRNA组的克隆数分别为344.55±29.67、318.20±23.22和102.65±9.87，OCT4-shRNA组与control-shRNA组相比克隆数显著降低（P＜0.05），与parental组相比克隆数也显著降低（P＜0.05），control-shRNA组与parental组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。7FCM检测细胞凋亡和细胞周期的变化，结果显示，与parental组和control-shRNA组相比，乳腺癌细胞系MDA-MB-231感染OCT4-shRNA后，细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）。并且，下调MDA-MB-231细胞OCT4基因表达后，细胞周期阻滞于G1期。结论：OCT4在乳腺癌组织中的表达与上皮标志物E-cadherin的表达成负相关与间质标志物vimentin的表达成正相关，这就说明OCT4可能通过EMT促进了乳腺癌细胞的转移。OCT4基因的阳性表达是影响乳腺癌预后的独立因素。OCT4-shRNA质粒能够有效沉默OCT4基因的表达，可抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，同时，EMT相关标志物E-cadherin表达上调，vimentin表达下调，结果提示OCT4介导的肿瘤发生与EMT的调控有关，OCT4可能成为临床一个新的治疗靶点。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-12
引言  12-14
第一部分干细胞相关因子 OCT4 与 EMT 相关因子在浸润性乳腺癌中的表达以及与临床病理特征和预后的关系  14-34
  前言  14-15
  材料与方法  15-21
  结果  21-23
  附图  23-27
  附表  27-29
  讨论  29-30
  小结  30
  参考文献  30-34
第二部分探讨 shRNA 干扰 OCT4 后对乳腺癌细胞侵袭、增殖和凋亡的影响  34-65
  前言  34
  材料与方法  34-45
  结果  45-48
  附图  48-58
  附表  58-60
  讨论  60-62
  小结  62
  参考文献  62-65
综述上皮间质转化与乳腺癌关系的研究进展  65-76
  参考文献  70-76
致谢  76-77
个人简历  77

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