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肝癌干细胞耐药索拉非尼相关信号途径的探索

作　者: 晏紫
导　师: 钱其军
学　校: 第二军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 肝癌干细胞索拉非尼耐药 PDGFRB MEK信号通路
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究目的检测索拉非尼对肝癌干细胞的药效，研究肝癌干细胞耐药索拉非尼的关键基因和相关信号通路，探索逆转其耐药性的可能途径，从而为临床靶向肝癌干细胞的肝癌治疗方案提供理论基础，为索拉非尼耐药性肝细胞癌的治疗提供新思路。研究方法应用本实验室自建的无血清培养体系，用球培养法培养富集肝癌干细胞Huh7C和Hep3B C，进行下列研究：1.形态学观察和CCK8法检测索拉非尼对肝癌干细胞及其对应肝癌细胞的药效，比较肝癌干细胞及其对应肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性；2. PI单染法和Annexin V/PI双染色流式法检测索拉非尼对肝癌干细胞及其对应肝癌细胞的增殖和凋亡情况的影响；3.将肝癌干细胞及其对应肝癌细胞进行表达谱深度测序并筛选差异表达基因，对照GeneGO数据库得到肝癌干细胞耐药索拉非尼的候选基因，并将候选基因返回到KEGG数据库预测肝癌干细胞耐药索拉非尼的相关途径；4. RT PCR、免疫印迹和免疫荧光从RNA水平和蛋白水平验证肝癌干细胞耐药索拉非尼关键基因表达；5. CCK8法检测预测的耐药相关途径抑制剂与索拉非尼联合用药对肝癌干细胞的作用，免疫印迹验证联合用药对预测的相关途径作用机制。研究结果1.肝癌干细胞及其肝癌细胞对索拉非尼的敏感性有差异，在有效药物浓度范围内，肝癌干细胞Huh7C和Hep3B C比肝癌细胞Huh7和Hep3B对索拉非尼的耐药性更强，索拉非尼作用后肝癌干细胞仍能维持较完整的细胞球生长形态和较通透的细胞状态，而肝癌细胞已难以维持其贴壁生长且有较多细胞发生皱缩；2.索拉非尼对肝癌细胞有明显的抑制增殖和促进凋亡效果，通过抑制增殖和促进凋亡达到其治疗肝癌的效果；但是相同用药条件下索拉非尼对肝癌干细胞的增殖和凋亡影响不大，难以完全消除肝癌干细胞。3.将肝癌干细胞的表达谱深度测序结果进行差异基因筛选（FoldChange>2orFoldChange<0.5）得到1012个同向差异基因，与GeneGO数据库中所得索拉非尼作用位点相关的7个基因比较，得到4个肝癌干细胞特异耐药索拉非尼候选基因B RAF，C KIT，RAF1和PDGFRB。将候选基因返回到KEGG数据库，预测肝癌干细胞耐药索拉非尼的相关通路为MEK信号通路。4.肝癌干细胞的PDGFRB表达在RNA水平和蛋白水平均低于对应肝癌细胞，这一结果与表达谱深度测序结果一致，证实PDGFRB基因表达在肝癌干细胞中普遍下调。5.肝癌细胞的MEK信号通路易受索拉非尼作用影响，ERK1/2的表达水平与索拉非尼药物浓度梯度呈负相关。肝癌干细胞的ERK1/2表达水平较低，细胞MEK信号通路较稳定，不易受索拉非尼药物作用影响。ERK通路抑制剂U0126与索拉非尼联合用药明显抑制肝癌干细胞的活力，逆转肝癌干细胞对索拉非尼的耐药性。研究结论与肝癌细胞相比，肝癌干细胞对索拉非尼作用有较强的耐药性。肝癌细胞的MEK信号通路易受索拉非尼用药影响，随着用药浓度增加，ERK1/2表达逐渐降低。已发现的索拉非尼作用相关基因中，PDGFRB在肝癌干细胞上的表达较低，使索拉非尼通过PDGFRB对MEK信号通路的抑制作用受限，所以肝癌干细胞能维持并不活跃但稳定的MEK通路活性，保证自身的细胞基本生命活动，逃脱索拉非尼的抑制增殖和促进凋亡作用。MEK信号通路抑制剂U0126与索拉非尼联合用药能有效抑制肝癌干细胞的活力，逆转肝癌干细胞对索拉非尼的耐药性。

肝癌干细胞耐药索拉非尼相关信号途径的探索

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