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多肽CT3依赖STAT3抑制microRNA-155的表达促进HL-60细胞分化

作　者: 徐莎
导　师: 刘厚奇
学　校: 第二军医大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: AML microRNA-155 白血病抑制因子 STAT3 TAT蛋白转导结构功能域
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF）是IL-6细胞因子家族中的一员，它具有多种生物学效应。有报道称在体外LIF对U937、HL-60、小鼠M1细胞具有抑制生长的能力，并且诱导细胞像成熟血细胞方向分化的作用。可白血病细胞由于增殖失控，因此对LIF的敏感度较低，导致体内有限的LIF对白血病细胞的恶性增殖无法抑制，同时非生理剂量、外源性的LIF也会对正常组织以及正常细胞产生较大的毒副作用，并会干扰细胞因子间的调控网络，所以它不能直接应用于临床治疗。LIF发挥其生物学作用是借助与靶细胞膜上的LIF受体发生结合而得以实现的。LIF受体包括LIFRα和gp130这两个亚基。LIFRα由胞内区，跨膜区和胞外区三部分组成。其中胞内区含重要作用结构为YXXQ的功能域，分别为Box1、Box2和Box3。YXXQ中的氨基酸分别为：Y代表酪氨酸，X代表任意氨基酸，Q代表谷氨酰胺，该结构是活化胞内信号分子的必要序列。我们以往的研究已表明，通过基因转染的方式，将LIFRα亚基中胞内区含Box3功能域的C末端序列（LIFRα-CT3）过表达于HL-60细胞胞质中，可促进细胞朝成熟粒细胞方向分化，并抑制其增殖能力。然而，脂质体或是病毒等基因转染方式只能应用于体外试验，在临床治疗上存在一定的安全风险和技术限制。因此，我们借助蛋白转导结构域（Protein Transduction Domain, PTD）能将蛋白跨膜携带进入细胞内的特性，采用CHO（中国仓鼠卵巢细胞）真核表达体系制备了LIFRα-CT3融合多肽，即TAT-CT3-cMyc（cMyc为蛋白纯化标签）。实验结果表明该融合多肽确实能抑制HL-60细胞增殖，并向粒系分化。由于该表达体系获得的融合多肽存在表达量少、浓度低、成本高的缺点，不利于今后对该蛋白与白血病细胞间的机制研究，所以要获得大量的、高浓度的融合蛋白TAT-CT3显得非常有必要。信号转导和转录激活子STAT3参与细胞增殖、分化、恶性转化及凋亡机制。现有研究发现在多种肿瘤中均存在STAT3蛋白的持续性磷酸化的高表达，参与肿瘤的发生。因此，阻断JAK/STAT3通路已作为肿瘤治疗的一个治疗新靶点。而近几年的研究已证实STAT3异常持续性的激活与白血病的发生、发展有着密切关系，因此我们推测HL-60细胞分化可能与STAT3磷酸化的降低存在着某种联系。MicroRNAs（miR）是一类由内源性基因编码的，序列长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA，它通过调控其下游靶基因，参与细胞的生长和分化过程，与肿瘤的发生也有着密切联系。一些microRNAs已被证实为致癌性小RNA，与急性髓系白血病（acutemyelocytic leukemia，AML）的发生密不可分。在这些致癌性小RNA中，miR-155在血液系统的恶性肿瘤中呈高表达趋势，同样也高表达于某些分型的AML白血病细胞。miR-155位于B-cell Integration Cluster（bic)基因的第三个外显子内，其表达水平受到BIC基因的转录和miRNA加工等调控。虽然STAT3和miR-155分别被视作癌基因和致癌性小RNA，两者又都在白血病中存在高表达的现象，但是在对白血病的研究中，两者之间的联系鲜有相关的文献报道。同时，C/EBPβ作为miR-155的下游靶基因，在粒系分化中有着重要的作用。因此，探索STAT3与miR-155之间的关系对研究TAT-CT3对HL-60细胞分化的作用机制是十分有必要的，并且也对靶向STAT3的肿瘤治疗有更多维的认识。本实验的目的是想通过技术上已成熟的原核表达系统制备大量有活性的TAT-CT3融合多肽，观察其是否具备像真核表达的多肽一样，对HL-60细胞的生长和分化有相似的作用，并研究在HL-60细胞分化过程中STAT3磷酸化水平以及miR-155表达的变化，并探讨两者在HL-60细胞分化中的作用及其相互关系。在本实验中，我们应用原核表达系统获得高表达的带有SUMO标签的TAT-CT3多肽,用FITC加以标记，以50μg/ml的浓度、作用HL-60细胞1h后，通过免疫荧光检测证实了TAT-CT3能够进入HL-60细胞内。接着，多肽以10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml的浓度处理HL-60细胞4天后，经流式细胞仪分析发现，经50μg/ml的终浓度暴露的细胞，其细胞分化表面标志物CD11b表达增加最多，以此确定后续实验所需的最佳多肽剂量。之后以50μg/ml的终浓度作用24h,48h,72h,98h，分别检测细胞增殖以及CD11b/14的表达变化。实验结果表明原核表达的TAT-CT3多肽具有真核表达蛋白的生物活性，可以诱导HL-60细胞向粒系方向分化，同时能抑制该细胞的增殖。为了进一步研究TAT-CT3多肽在其抑制细胞增殖诱导分化的过程中，是否能降低STAT3持续性磷酸化水平以及miR-155的表达水平，以50μg/ml的TAT-CT3对HL-60细胞进行为期4天的暴露。通过Western Blotting以及qRT-PCR的方法检测，结果表明STAT3磷酸化水平在24h,48h,72h,98h后有所下降，miR-155及其前体BIC同样表达有所下降。miR-155其下游的靶基因有SOCS-1、C/EBPβ，SOCS-1是JAK/STAT通路的负调控因子，C/EBPβ在粒系细胞分化过程中有重要的诱导作用，因此我们在mRNA以及蛋白水平分别检测了它们的表达情况，结果表明，随着多肽暴露时间的延长，SOCS-1以及C/EBPβ表达都有所上升。在本教研室的前期实验中已证实了HL-60细胞的分化是通过激活和强化STAT3的磷酸化来实现的，这一结果与本课题中STAT3磷酸化的降低存在矛盾性。有研究表明IL-6通过激活STAT3的磷酸化从而诱导SOCS-1的表达，一旦SOCS-1表达上升，它作为JAK/STAT3通路的负调控因子又抑制STAT3的磷酸化。我们通过qRT-PCR以及WesternBlotting检测发现，当加入TAT-CT3后，在0-2小时之间，STAT3磷酸化增加的同时伴有SOCS-1表达的上升，而在2小时后，STAT3磷酸化被SOCS-1抑制而降低，并低于未经TAT-CT3暴露前的磷酸化水平。这一结果说明TAT-CT3通过强化STAT3磷酸化水平促进了SOCS-1的表达，SOCS-1表达的升高反作用于STAT3，使其磷酸化降低。SOCS-1表达增加伴随着STAT3磷酸化的增强，而SOCS-1是miR-155的下游靶基因，以此推测STAT3是作用于miR-155来调控SOCS-1的表达。并且STAT3作为信号转导和转录活化因子，当被激活后会形成二聚体入核，可以调控基因的表达。因此对野生组以及TAT-CT3组HL-60细胞进行4天的连续暴露（50μg/ml，每日换液）后分别检测pSTAT3在转录因子启动子区的水平变化。CnIP实验结果表明，STAT3能够结合至BIC启动子区域。我们可以推断在多肽TAT-CT3加入至HL-60细胞培养基后，STAT3磷酸化一过性的增强促进其二聚体的形成并入核，结合至BIC启动子区抑制了miR-155的表达，从而促进SOCS-1的表达。总之，本研究制备了有活性的原核表达的TAT-CT3融合多肽，它能够抑制HL-60细胞增殖并促进其向粒系分化。首次证明了STAT3能直接结合到BIC的启动子区，调节miR-155的表达，这也为靶向miR的肿瘤治疗提供一定的借鉴意义。

多肽CT3依赖STAT3抑制microRNA-155的表达促进HL-60细胞分化

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