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目的：骨再生是治疗骨骼系统相关疾病如骨缺损、骨折不连接和治疗骨质疏松的关键环节。组织工程骨有望解决植骨后新骨形成缓慢的问题,其中如何促进种子细胞的增殖和成骨分化成为组织工程技术的关键环节和研究热点。在促进骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演着重要的角色,目前较多研究显BMP2,BMP4,BMP6,BMP7,BMP9具有骨诱导活性的；另外,Wnt3a在成骨细胞分化和增殖过程起着重要作用。上述调节因子的联合作用很可能加强诱导成骨分化,但是有关的研究少见报道。利用基因治疗技术可以将成骨诱导因子导入种子细胞,通过持续高水平表达成骨诱导因子促进种子细胞的成骨分化。选择理想的载体,使目的基因靶向、可控并有效地表达,是基因治疗成功的关键。非病毒载体系统的基因转移方法效率较低,其应用受到了很大限制；目前常用的病毒性载体主要有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等,存在着只能瞬时表达、基因丢失、细胞恶化风险等不足。本研究则使用慢病毒载体并观察联合转染的应用前景。以HIV-I为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗,因此有望成为理想的基因转移载体。本研究拟构建第三代自体失活的BMP2, BMP4, BMP6,BMP7,BMP9, Wnt3a慢病毒表达载体,并整合入小鼠间充质干细胞MC3T3-E1的基因组中,构建成骨诱导因子基因修饰的小鼠类间充质干细胞,探讨各成骨诱导因子的成骨分化能力；并通过双基因联合转染,探讨进一步提高成骨分化能力的有效方法。方法：1.以cDNA文库为模板,应用PCR方法获得BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a基因的编码序列,扩增得到的片段与经Nhe I和Sal I双酶切后与pELNS双酶切后纯化片段连接,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。2pLP/VSVG, pLP2, pLPl质粒与BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。Real time PCR检测Runx2mRNA的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。3.双基因联合转染(共8组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果；应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平；应用Real time PCR检测Runx2mRNA的表达水平；应用Western blot检测BMP2,BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。结果：1.pELNS-BMP-2, pELNS-BMP-4, pELNS-BMP-6, pELNS-BMP-7pELNS-BMP-9, pELNS-wnt3a表达质粒构建成功。2.重组慢病毒pELNS-BMP-2, pELNS-BMP-4, pELNS-BMP-6, pELNS-BMP-7, pELNS-BMP-9, pELNS-wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2mRNA表达水平：BMP2>BMP4>BMP9>BMP7>wnt3a>BMP6。3.双基因(共8组)联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功；Runx2mRNA表达水平：T5>T3>T8>T1>T2>T6>T4>T7;BGP表达：T5> T3>T8>T4>T2>T6>T1>T7,LP表达：T5>T3>T1>T8>T2>T4>T6>T7;结果显示,T5(BMP-2, BMP-7)共转染成骨效率最高,Western blot证实BMP2和BMP7联合转染MC3T3-E1细胞后BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a蛋白表达升高。结论：第三代慢病毒载体pELNS可将BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP9, Wnt3a导入小鼠间充质干细胞MC3T3-E1,使其有效表达；各成骨诱导因子能促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化,BMP2和BMP7双基因联合转染能有效提高成骨转化,这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。
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