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靶点灌注臭氧治疗慢性骨髓炎的实验研究

作　者: 刘德鼎
导　师: 康一凡
学　校: 第二军医大学
专　业: 外科学
关键词: 盐酸万古霉素微透析药代动力学药效学高效液相色谱法序贯疗法
分类号: R681.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

慢性骨髓炎一直是医学界公认的顽疾之一，被喻为“第二癌症”。尽管新一代抗菌药物抗菌活性不断提升，手术干预手段日趋完善，但慢性骨髓炎的复发率仍高达20-30%[1]，部分伤员最终不得不行截肢术，不仅给患者个人带来巨大的身心痛苦，而且给家庭及国家带来沉重的经济负担[1,2,3]。因此，缩短慢性骨髓炎的治疗时间，提高治愈率，降低致残率，具有重大的临床意义和社会意义。当前治疗慢性骨髓炎所形成的共识是：彻底清创和伤口引流的基础上给予抗菌药物治疗[3]。抗菌药物贯穿于慢性骨髓炎的治疗过程并决定着治疗的成败。近年来，虽然抗菌新药不断推出、给药方式不断改进，但治疗效果并不十分理想[4]。病灶内游离态抗菌药物浓度不足导致治愈率低和复发率高等问题始终未能彻底解决。臭氧是一种强氧化剂，具有广谱高效杀菌作用，近年来的实验研究表明，适当浓度的臭氧还具有杀灭细菌生物膜、调节机体氧化应激、改善组织微循环等作用。本课题首先建立靶点灌注臭氧治疗兔胫骨慢性骨髓炎模型，利用微透析取样技术对靶组织抗菌药物－万古霉素的药代动力学进行研究，探讨臭氧与抗菌药物的协同作用关系；其次，通过测定靶组织IL-6、TNF-α的含量，并通过影像学、病理学和微生物学手段评估疗效，摸索出臭氧局部治疗的有效方案。通过本实验研究，我们试图阐明局部应用臭氧治疗慢性骨髓炎的内在作用机制，从而为慢性骨髓炎的治疗开辟新思路与新途径。一、目的：建立兔慢性骨髓炎模型，静脉给予盐酸万古霉素，并在骨组织局部灌注臭氧，采用微透析技术联合反相高效液相色谱(HPLC)同步测定盐酸万古霉素在兔骨组织和血液中规定时间点的游离药物浓度，观察盐酸万古霉素在骨组织和血液的药代动力学变化特点，探讨臭氧与抗菌药物的协同作用关系；其次，定量分析骨髓炎病灶部位炎症因子（IL-6、TNF-α）的变化与臭氧的关系，初步揭示臭氧抗感染治疗的机制，为臭氧联合万古霉素治疗慢性骨髓炎提供依据。二、材料和方法：1、万古霉素的药动学研究部分：雄性新西兰大白兔18只，体重2-2.5Kg，随机分为3组，分别为正常组，慢性骨髓炎万古霉素治疗组，臭氧联合万古霉素治疗组。实验前18小时禁食不禁水。三个实验组均经兔耳缘静脉给予盐酸万古霉素30mg/Kg，臭氧干预组在静注万古霉素前给予臭氧2ml（40μ g/mL），采用微透析技术对骨组织和血液进行同步取样，联合反相高效液相色谱技术实时检测骨组织和血液中盐酸万古霉素的浓度变化，所得药物浓度数据用WinNonlin软件处理。2、臭氧抗感染治疗的机制研究：雄性新西兰大白兔18只，体重2-2.5Kg，随机分为3组，分别为正常组，慢性骨髓炎对照组，慢性骨髓炎臭氧干预组。臭氧干预组给予臭氧2ml（40μ g/mL），采用微透析技术对骨组织进行取样，联合ELISA法对样品中的IL-6、TNF-α进行定量分析。三、结果：1、药代动力学研究：正常兔血液中的游离万古霉素浓度在静注后10min达峰，为41.5±2.71μg/ml，骨组织也在10min时到达峰浓度40.57±2.50μg/ml，两者浓度在100min前始终保持接近；100min后，血液中的药物浓度开始高于骨组织，并持续至观察点结束。慢性骨髓炎组病灶部位骨组织中的万古霉素含量较血液明显降低，10min达峰浓度分别43.31±2.67μg/ml（血液），16.35±1.67μg/ml（骨）。臭氧干预治疗后，病灶骨组织的万古霉素浓度明显提高，达到44.37±2.31μg/ml（血液），20.58±4.85μg/ml（骨），但仍低于正常骨组织的药物浓度。血液、骨组织的药时曲线下面积AUC0-inf在三个实验组分别为：正常组：5280.31±205.73min*μg/ml （血液）和5065.03±209.56min*μg/ml （骨）；慢性骨髓炎万古霉素治疗组：5106.45±205.73min*μg/ml（血液）和1259.53±48.42min*μg/ml（骨）；臭氧联合万古霉素治疗组：5353.51±325.58min*μg/ml（血液）和1873.43±573.7min*μg/ml（骨）。2、炎症因子变化研究：IL-6、TNF-α在臭氧灌注后均明显下降，在慢性骨髓炎组，病灶部位IL-6和TNF-α的含量分别为：318.1±2.82pg/ml-361.42±8.52pg/ml，231.48±14.89pg/ml-267.13pg/ml；臭氧干预组病灶部位和正常组骨组织的含量分别为79.60±10.12pg/ml-277.16±10.02pg/ml，59.37±10.57pg/ml-112.06±14.85pg/ml（TNF-α）；127.36±13.83pg/ml-371.69±11.97pg/ml，91.91±10.57pg/ml-227.27±17.75pg/ml（IL-6）。四、结论：微透析采样技术具有良好的时间和空间分辨性，联合反相高效液相色谱检测方法可以准确客观地反映药物在慢性骨髓炎病灶组织和血液中的药代动力学特点，是进行药动学研究的良好工具。实验证明，静脉给药时盐酸万古霉素具有良好的骨组织穿透性。与血浆药动学参数相比，正常骨组织的达峰浓度及达峰时间无差别，但在慢性骨髓炎病灶部位，骨组织中的游离态药物浓度显著低于血浆药物浓度。臭氧干预后病灶组织的药物峰浓度和最低浓度较单纯应用万古霉素有所提高，显示臭氧与万古霉素间具有协同作用，该现象可能通过臭氧促进糖酵解酶类合成，加快糖代谢，增加NO、CO等物质生成，扩张微血管，改善局部循环完成。进一步研究显示臭氧可以调节炎症因子的表达，显著降低IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平，结合国内外研究，臭氧可通过引起α-synuclein蛋白在细胞内积聚，抑制核转录因子NF-KB的活性，使之不能进入细胞核内，抑制细胞表达IL-10、IL-6、TNF-α等炎症因子。虽然臭氧的协同作用无法将万古霉素的骨组织含量提高到正常水平，但可延长万古霉素在骨组织的驻留时间，这对于时间依赖性的抗菌药物具有重要意义。同时臭氧的应用可减轻局部慢性炎症的反复刺激，有利于炎症消除，并可抑制破骨细胞的活性，有利于骨组织重建。综上所述，病灶局部灌注臭氧治疗慢性骨髓炎具有积极意义，为慢性骨髓炎的治愈提供了一条新的途径。

靶点灌注臭氧治疗慢性骨髓炎的实验研究

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