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人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株的建立及鉴定

作　者: 王保亚
导　师: 杨洁
学　校: 天津医科大学
专　业: 免疫学
关键词: Tudor-SN蛋白乳腺癌迁移力侵袭力 MMP-2 MMP-9
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究目的：乳腺癌(Breast Cancer, BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一,已成为全球范围内发病率最高的女性恶性肿瘤之一。和其它实体瘤相似,乳腺癌也具有很强的远处转移的倾向,如转移到肺、肝和骨等部位。Tudor-SN(tudor staphy-lococcal nuclease)蛋白表达于乳腺上皮细胞,主要分布于胞浆内质网和细胞器中。Ho J等学者根据质谱分析技术对小鼠乳腺癌转移模型进行分析,并结合临床转移性乳腺癌组织标本,发现转移性乳腺癌组织中高表达Tudor-SN蛋白。但是Tudor-SN蛋白如何影响乳腺癌的生物学行为,及相关的分子机制不清楚。本课题的研究目的旨在建立人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株,揭示Tudor-SN蛋白对高转移乳腺癌细胞生物学的影响及相关机制的初探,从而为乳腺癌的诊断和治疗提供一定的实验依据。研究方法：本课题分为三个部分进行研究：第一部分,应用lipofectamine-2000转染试剂将质粒pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231, G418筛选阳性克隆。第二部分Tudor-SN蛋白对乳腺癌细胞生物学行为的影响,分别应用Transwell小室体外侵袭实验、伤口愈合实验等,观察Tudor-SN蛋白稳定抑制表达细胞株和MDA-MB-231细胞体外侵袭能力、迁移能力的差异。第三部分,应用实时荧光定量PCR方法检测Tudor-SN蛋白稳定抑制表达细胞株和MDA-MB-231细胞中MMP-2和MMP-9mRNA水平影响,及小鼠乳腺癌组织稳定抑制表达组和未处理组MMP-2和MMP-9mRNA水平的影响。研究结果：①第一部分通过倒置荧光显微镜肉眼观察并挑选出生长状态好、荧光强的单克隆细胞株。经PCR技术及western技术鉴定,pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞Tudor-SN mRNA及蛋白表达量均明显低于pGenesil-shRNA-HK阴性对照组细胞和／或未转染的对照组细胞,显示pGenesil-shRNA-hTudor-SNI稳定株细胞筛选成功。②第二部分结果表明：(1)pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞侵袭能力低于未转染的对照组细胞；(2)pGenesil-shRNA-hTudor-SNI转染组细胞迁移能力低于未转染的对照组细胞。③第三部分结果表明：实时荧光定量PCR技术鉴定,Tudor-SN稳定表达抑制细胞株中MMP-2mRNA水平低于未转染的对照组细胞,MMP-9mRNA水平高于未转染的对照组细胞；小鼠乳腺癌组织Tudor-SN抑制组MMP-2mRNA低于未处理组,MMP-9mRNA水平高于未转染的对照组细胞,细胞和组织水平结果一致。结论：①成功筛选出pGenesil-shRNA-hTudor-SNI稳定抑制表达MDA-MB-231细胞株。②Tudor-SNI稳定表达抑制组细胞与空白对照组细胞相比,体外侵袭能力和迁移能力降低,Tudor-SN对乳腺癌细胞的体外侵袭能力和迁移能力具有促进作用。说明Tudor-SN可能与乳腺癌细胞侵袭能力和迁移能力有关。③Tudor-SN可以上调人乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌组织MMP-2mRNA水平,下调人乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌组织MMP-9mRNA水平,为进一步研究Tudor-SN对乳腺癌侵袭和转移过程中的分子机制提供实验依据。

人类Tudor-SN蛋白表达抑制MDA-MB-231稳定株的建立及鉴定

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