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乳房肥大患者雌激素受体α基因表达及多态性的分析

作　者: 李静怡
导　师: 栾杰
学　校: 北京协和医学院
专　业: 外科学
关键词: 乳房肥大雌激素受体基因多态性芯片内含子
分类号: R655.8
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

一.研究背景：乳房不但做为女性的第二性征和哺乳器官满足生理的需要,而且它也是形成人体曲线美和体现女性魅力的重要结构。乳房的过度肥大会给女性带来肉体和心理的双重痛苦。虽然治疗乳房肥大的手术逐渐的成熟和完善,但对其发病原因的研究相对较少,发病机制仍不明了。乳房的发生和发育受多种激素和体液因子的调节,而雌激素做为女性的主要性激素,在其中起着重要的作用。作为生长因子,雌激素促进正常乳腺细胞和癌细胞增殖。人们对乳房肥大病因的研究大多数都集中在雌激素和雌激素受体(Estrogen Receptor, ER)上面,结果不一,观点各异。研究发现：在绝大多数的乳房肥大症患者中血清的雌激素水平是正常的；乳房肥大的发生可能与ER含量升高有关,小乳房则与ER含量或敏感性降低有关。但有学者认为乳房肥大与ER含量没有直接关系。ER基因调控一系列基因表达及介导细胞内信号转导,ER基因的多态性可能改变基因的转录调控水平从而影响雌激素的生理功能。人的ER包括a和β两种亚型。各亚型在乳腺组织细胞中均有不同的表达,发挥不尽相同的作用,大量研究证明ERa基因更多的承担着雌激素介导作用。有报道：ERa基因多态性可能通过影响雌激素的敏感性与乳腺癌的发生有关,ERa基因Xba Ⅰ基因多态性与乳腺增生症的发病有关,而ERa基因Pvu Ⅱ基因多态性则与其无明显相关。因此,ERa基因是否是乳房肥大和小乳房发生的关键因素、其生物学机制如何?还需进一步的研究。二.目的：探讨国人乳房肥大患者的ERa基因与相关基因的表达差异以及乳房肥大与ERa基因多态性的关系,以期为乳房肥大症的诊断、治疗和预防提供理论依据。三.方法：1)选取2011年8月～10月我院收住的3名女性乳房肥大患者与行乳房纤维腺瘤切除术的3名女性患者作为研究对象。手术中取乳房肥大患者废弃的乳腺组织和乳腺纤维腺瘤患者距离病灶3cm的位置的乳腺组织,分别作为实验组和对照组,应用Illumina芯片来进行全基因组扫描而找到差异基因,分析ERa基因与下丘脑-垂体-性腺轴的促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)、黄体生成素(Luteinizing hormone, LH)、卵泡雌激素(Follicle stimulating hormone,FSH)等相关基因的表达差异。2)选取2009年12月-2011年6月我院收住的年龄18-45岁的乳腺发育异常的女性患者和乳房大小形态正常的健康女性作为研究对象。分为三组：(1)乳房肥大组(28例)：左右两侧每侧乳腺切除的重量≥350g的患者；(2)小乳组(70例)：经乳晕切口、腋窝切口行隆乳术患者,经术前测量乳房组织总量在200g以下；(3)正常对照组(69例)：乳房大小及形态正常的健康女性。收集入组对象外周全血样本,应用PCR-限制性酶切方法对三组进行基因组DNA ERα基因的Xba Ⅰ和Pvu Ⅱ酶切多态性位点研究,对结果进行了相应的统计学分析并采用限制性片段长度多态性(RFLP)分析。3)利用报告基因技术,将上述乳房肥大组、小乳组和正常乳房组的人群中的第一内含子中具有增强子、启动子作用序列克隆入报告基因载体pGL3-Basic,重组报告基因载体质粒与内参照质粒pRL-TK一起转染入乳腺癌细胞(MCF-7),化学发光仪检测转染后细胞荧光素酶的相对活性,分析三组人群第一内含子多态性对雌激素受体基因转录水平的差异。并利用双荧光素酶报告基因技术对基因突变进行转录调节能力研究。四.结果：1.乳房肥大患者的ERa基因与相关基因的差异性表达本研究共筛选分析得到2808个差异表达的mRNA,其中上调的1815个,下调的993个和223个差异表达的miRNA基因,其中有123个(占55%)差异表达基因为上调]miRNA基因,100个(占45%)基因为下调miRNA基因。其中ERa基因在乳房肥大组是上调的,而与下丘脑-垂体-性腺轴相关的GnRH、LH、FSH基因的表达水平均无上调或下调,提示ERa基因和乳房肥大的发生有关。通过进行两类基因对应基因组序列富集分析,发现上调表达基因主要富集在GnRH信号传导通路、趋化因子信号传导通路,Fc7受体介导的吞噬作用,内皮细胞介导的白细胞迁移途径及血管平滑肌收缩作用等途径中；而下调表达基因主要富集在氧化磷酸化、蛋白酶体、心肌收缩作用、柠檬酸盐循环(TCA循环)、mRNA介导的信号传导通路及泛素介导的蛋白酶解等途径中。2. ERαPvuⅡ和Xba Ⅰ多态性与乳房肥大和小乳房的关系1)ERa基因上Pvu Ⅱ酶切位点分析结果为：正常对照组：PP型、Pp与PP型分别是10.14%、68.12%和21.74%；乳房肥大组：PP型、Pp与PP型分别是25%、57.14%和17.86%；两组比较差异无统计学意义(p>0.05)。小乳组：pp型40%,与正常对照组比较差异有统计学意义(p<0.0001)；Pp型47.14%,与正常对照组比较差异有统计学意义(p=0.0124)2)ERa基因Xba Ⅰ的酶切多态性分析结果为：正常对照组：xx, Xx与XX分别为63%、10%和26%。乳房肥大组：xx, Xx与XX分别为25%、64%和1O%,与正常对照组等位基因构成比较差异有统计学意义(p<0.0001)。小乳组：xx, Xx与XX分别为77%、21%和0.10%,与正常对照组等位基因构成组比较差异也有统计学意义(p<0.0001)。3)PvuⅡ酶切多态性相对易感度分析：小乳组：P和p两等位基因的OR值为0.4540(95%CI：0.2093～0.8326),即可能p基因是小乳症的易感基因；隐性基因型PP与pp携带者的OR值为0.15(95%CI：2.3622～14.7604),说明小乳症与pp基因型有关联。4)Xba Ⅰ酶切多态性相对易感度分析：乳房肥大组：X和x两等位基因的OR值为1.6570(95%CI：1.8735～3.1431),提示X基因是该疾病的易感基因；隐性基因型xx与X携带者的OR值为0.1894(95%CI：0.0706～0.5078),杂合子与纯合子基因型的OR值为15.9429((95%CI：5.3110～47.8580),提示乳房肥大症发生与Xx基因型有关联。小乳组：X和x两等位基因的OR值为0.305(95%CI：0.1639～0.5688),即可能x基因是该疾病的易感基因；隐性基因型xx与X携带者的OR值为1.9176,(95%CI：1.9121～4.0317)提示小乳症与xx基因型有关联。3.双荧光素酶报告基因活性测定结果：正常对照组、乳房肥大组和小乳组荧光素酶的相对活性分别为2.66±1.41、3.13±1.17和1.97±0.79。乳房肥大组荧光素酶的相对活性较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05),小乳组荧光素酶的相对活性较正常对照组显著降低,差异有统计学意义(p<0.01)。各组标本XbaI多态性与荧光素酶的相对活性对比分析：xx基因型的ERa基因启动转录表达活性显著低于xX和XX基因型,小乳组中xx基因型的ERa基因启动转录表达活性显著低于正常对照组中xx基因型。乳房肥大组中XX基因型的ERa基因启动转录表达活性显著高于对照组XX基因型个体,但xX和xx的ERa基因启动转录表达活性与对照组差异无统计学意义。结合第二部分结果,乳房肥大组中XX基因型个体仅占10.1%(3/28)。推测XX基因型的ERa基因启动转录表达水平升高可能不是巨乳形成的主要原因。正常组和小乳组中pp基因型的雌激素受体基因启动转录表达活性显著低于pP和PP基因型；小乳组中pp基因型的ERa基因启动转录表达活性显著低于正常组中pp基因型；乳房肥大组中PP基因型的ERa基因启动转录表达活性显著高于正常组中PP基因型,提示肥大组中PP基因型的ERa基因表达上调；肥大组中pp和pP基因型的ERa基因启动转录表达活性与正常组中pp和pP基因型无显著性差异。结合第二部分结果,乳房肥大组中PP基因型占17%(5/28),提示尽管ERa基因Pvu Ⅱ PP基因型与ERa基因启动转录表达水平上调有关,但可能不是巨乳形成的主要原因。五.结论：1)应用基因芯片技术对乳房肥大组和正常对照组进行的全基因组的扫描结果结合上调基因主要富集的通路分析发现：乳房肥大患者组中ERa基因表达是上调的,而与乳房的发育有着密切的关系的下丘脑调节垂体-性腺-雌激素轴相关的GnRH基因、LH基因、FSH基因的表达水平均无上调或下调,提示ERa基因和乳房肥大的发生有关。从而从基因层面上支持了ERa基因表达的上调是导致乳房肥大的发生的因素之一。同时还提示,其他基因的表达也存在着明显的差异,说明乳房肥大的发生可能是一个由多种基因和多种通路参与的复杂的生物学网络。2)乳房肥大的发生与杂合基因型xx有关,而小乳症的发生与隐性基因型pp及xx有关,乳房大小和形态的差异并非由某个基因差异决定的。3)ERal号内含子多态性可导致雌激素受体基因转录表达的启动水平的差异；乳房肥大组人群ERal号内含子的增强子和启动子的调节序列,对ERa基因转录表达的启动水平,显著高于正常对照组人群,而小乳组人群,则显著低于正常对照组人群。结合对乳房肥大和小乳症ERa基因多态性的研究,推测xx和pp这两个基因型的低水平启动转录表达可能是小乳症形成的部分原因。尽管ERa基因Pvu Ⅱ PP基因型与ERa启动转录表达水平上调有关,但可能不是巨乳形成的主要原因。

全文目录

中文摘要  5-10
Abstract  10-16
缩略词表  16-17
第一部分应用基因芯片技术对国人乳房肥大患者基因差异表达的相关性研究  17-79
  摘要  17-19
  前言  19-21
  1 实验材料  21-23
  2 实验方法  23-40
  3 结果  40-73
  4 讨论  73-75
  5 结论  75-76
  参考文献  76-79
第二部分雌激素受体基因αPvu Ⅱ和Xba Ⅰ多态性与乳房肥大的关系  79-111
  摘要  79-81
  前言  81-83
  材料和方法  83-104
    1 研究对象的选择  83-84
    2 标本采集、处理  84
    3 实验材料和实验方法  84-91
    4. 数据统计学析  91-92
    5. 结果  92-98
    6. 讨论  98-104
  参考文献  104-111
第三部分雌激素受体基因α多态性的转录活性差异与乳房肥大关联分析  111-139
  摘要  111-113
  前言  113-114
  材料和方法  114-136
    1 实验材料  114-117
    2 实验方法  117-125
    3 实验结果  125-131
    4 讨论  131-135
    5 小结  135-136
  参考文献  136-139
第四部分综述  139-157
  综述一. 生物芯片技术的发展及其在乳腺疾病中的应用  139-150
    参考文献  145-150
  综述二. 雌激素受体基因与乳房疾病的相关性研究  150-157
小结  157-158
参考文献  158-161
致谢  161-162

乳房肥大患者雌激素受体α基因表达及多态性的分析

内容摘要

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