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骨化相关基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎的相关性分析

作　者: 刘泽英
导　师: 崔亚洲
学　校: 济南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 强直性脊柱炎易感性骨化单核苷酸多态性
分类号: R593.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，以骶髂关节和脊柱关节的慢性进行性炎症表现为主，并最终导致受累部位骨性强直。遗传因素在AS的致病机制中发挥重要作用，HLA-B27一直是AS疾病相关性遗传标记的最好例证。对AS的全基因组扫描研究不仅证实了HLA区域是与AS相关的重要区域,并且发现了HLA区域外还存在其他的AS易感区域。通过前期对国内外有关AS易感区域的Meta分析进行汇总，我们发现6p22.3-p21.1为AS最显著连锁区域，6pter-p22.3、3p22.1-p14.1、16q23.1-qter为热点区域。此外，16q12.2-q23.1、6p21.1-q15、10q23.33-q26.13、17pter-p12、2p12-q22.1、2q34-q35、5q34-qter、2p23.2-p16.2、11pter-p15.1、9q31.1-q33.3等区域也与AS存在连锁，这些区域最可能含有AS的易感基因。目前，对强直性脊柱炎易感基因的研究仍主要集中于炎症方面，仅少数研究是与钙化和/或异位骨化相关。新骨形成是AS发展中的一个主要过程，AS患者往往表现出明显的异位骨化现象。异位骨化主要受WNT、BMP等信号通路的调节，这些信号通路上位于易感区域的骨化相关因子极有可能为AS的骨化相关易感基因。本实验室首次提出了AS可能存在骨化相关的易感基因，并证实了LRP5基因的一个新的SNP位点(c.4488+74G> A)与AS相关。本研究在此基础上，对其他骨化相关基因进行了筛选。研究内容主要分为两部分：第一部分通过taqMan探针法对WNT5A、RHOA和MSX2这三个位于易感区域并与骨化相关的信号通路基因的6个tagSNP进行基因分型，分析其是否为AS骨化相关易感基因。第二部分通过多重Snapshot分型技术对ANKH和TNAP两个骨化相关基因的9个SNP位点进行基因分型，分析其是否为AS骨化相关易感基因。目的：通过对WNT5A、RHOA、MSX2、ANKH和TNAP这5个骨化相关基因多态性的研究，分析其SNP位点等位基因∕基因型与强直性脊柱炎之间的关联性，证明其是否为强直性脊柱炎易感基因。方法：本研究采用“病例-对照”的方法，taqMan探针法基因分型实验对象包括336例强直性脊柱炎患者以及336例健康人群作为对照。多重Snapshot法基因分型实验对象包括278例强直性脊柱炎患者以及286例健康人群作为对照。利用SHEsis、 Haploview4.0、 Plink及SPSS16.0等软件进行统计学分析。Hardy-Weinberg平衡分析、基因型和等位基因频率分析通过SHEsis-online在线软件；采用χ2检验的方法，计算SNP位点等位基因和基因型频率的差异；P<0.05为结果有统计学意义；利用SHEsis软件进行多重检验校正，permutations设为10,000；利用Haploview4.0进行连锁不平衡(LD)分析、单体型(haplotype)分析等。结果：(1)多重Snapshot方法分型结果ANKH基因rs26307位点基因型频率和等位基因频率分布在AS组和对照组中存在显著差异(genotype permutated p=0.00481, allele permutated p=0.0126)，rs27356位点基因型频率和等位基因频率在AS组和对照组中存在边缘差异(genotype permutated p=0.055, allele permutated p=0.0596)。rs26307位点T等位基因(OR=0.634,95%CI=0.475-0.847)明显的降低了发展为AS的风险性。ANKH单体型分析显示rs26307(C)/rs27356(T)单体型为AS的诱发因素(OR=1.53,95%CI=1.165-2.071, permutation10000corrected p=0.0103)；rs26307(T)/rs27356(C)单体型为AS的保护因素(OR=0.659,95%CI=0.487-0.890, permutation10000corrected p=0.0264)。(2) TaqMan探针法分型结果WNT5A基因rs472631位点基因型频率和等位基因频率分布在AS组与对照组中有统计学差异(genotype permutated p=0.029, allele permutated p=0.016)。进一步分析可知T等位基因为风险等位基因，C>T突变增加了AS的患病风险。WNT5A基因单体型分析结果显示rs472631（C）/rs11918967(C)单体型为AS的保护因素(OR=0.722,95%CI=0.567~0.918, permutation10000corrected p=0.008)；rs472631（T）/rs11918967(G)单体型为AS的诱发因素(OR=1.304,95%CI=1.001-1.700, permutation10000corrected p=0.049)结论：本研究发现WNT5A基因rs472631位点和ANKH基因rs26307位点多态性与AS易感性相关。由此可以说明WNT5A和ANKH基因可能是参与AS易感性的骨化相关基因。

全文目录

导师介绍  5
课题组成员  5-8
摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
英文缩略词表  14-15
前言  15-21
  1.HLA-B27 的作用  15-16
  2. AS 的全基因组扫描  16
  3.AS 易感基因研究现状  16-19
  4. 强直性脊柱炎的炎症和新骨形成  19-20
  5.骨化相关基因与强直性脊柱炎相关性研究  20-21
第一章 WNT5A、MSX2 和 RHOA 基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎的相关性分析  21-35
  1.1 材料  21-23
    1.1.1 研究对象和资料收集  21-22
    1.1.2 试剂  22-23
    1.1.3 主要仪器设备  23
  1.2 方法  23-29
    1.2.1 候选基因以及 SNP 位点的筛选方法  23-24
    1.2.2 基因组 DNA 提取  24-25
    1.2.3 DNA 浓度测定  25-26
    1.2.4 DNA 样品质检  26-27
    1.2.5 TaqMan 探针技术进行基因分型  27-28
    1.2.6 数据统计分析  28-29
  1.3 结果  29-31
    1.3.1 AS 组与对照组年龄和性别匹配度检验  29
    1.3.2 AS 组与对照组 H-W 遗传平衡检验  29
    1.3.3 关联分析  29-30
    1.3.4 连锁不平衡及单体型分析  30-31
  1.4 讨论  31-33
  1.5 小结  33-35
第二章 TNAP 和 ANKH 基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎的相关性分析  35-44
  2.1 材料  35-36
    2.1.1 研究对象和资料收集  35
    2.1.2 试剂  35-36
  2.2 方法  36-38
    2.2.1 候选基因以及 tag SNPs  36
    2.2.2 基因组 DNA 提取、质检  36
    2.2.3 Multiplex Snapshot 分型技术进行基因分型  36-38
    2.2.4 数据统计分析  38
  2.3 结果  38-42
    2.3.1 AS 组与对照组年龄和性别匹配度检验  38-39
    2.3.2 AS 组与对照组 H-W 遗传平衡检验  39
    2.3.3 关联分析  39-40
    2.3.4 连锁不平衡及单体型分析  40-42
  2.4 讨论  42-43
  2.5 小结  43-44
参考文献  44-47
综述  47-52
在校期间发表文章  52-53
致谢  53-54

骨化相关基因单核苷酸多态性与强直性脊柱炎的相关性分析

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