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AMPK及LXR通路新型天然调节剂的发现及相应作用机制研究

作　者: 庄静静
导　师: 沈旭
学　校: 华东理工大学
专　业: 药物化学
关键词: AMPK 耐力 LXR 炎症反应 Aβ
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本论文共分两部分,第一部分为AMPK激动剂的发现及其作用机制研究；第二部分为PGF2α作为LXR/RXR拮抗剂对Aβ调控的作用机制研究。目前普遍认为缺乏运动的生活方式以及过多的摄取高能量加工食品是引起代谢综合征,特别是2型糖尿病广泛流行的主要原因,由此产生的能量平衡的紊乱最终将导致2型糖尿病以及相应的心血管疾病的发生。研究发现,运动训练能够改变骨骼肌的纤维类型、促进线粒体的生物功能以及血管再生,从而起到促进脂肪酸氧化以及增加胰岛素敏感性的作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kianse, AMPK)作为细胞内重要的能量感受器,在调节整体能量平衡中起到重要的作用。AMPK激活后能够启动生成ATP的分解代谢通路,关闭消耗ATP的合成代谢通路,而且长期激活AMPK还能够模拟运动训练起到增加耐力的作用。因此,AMPK被认为是预防和治疗2型糖尿病的重要靶点,寻找AMPK激动剂在提高运动耐力、预防和治疗2型糖尿病中具有重要的意义。在本部分工作中,我们在模式细胞(HEK293T)中对一系列天然产物进行了AMPK激动活性的筛选,最终发现牛蒡子苷元(arctigenin, ATG)能够增加AMPK的磷酸化。继而在探讨ATG对肌肉细胞中AMPK活性影响的研究中发现：ATG能够浓度依赖的增加C2C12(骨骼肌细胞)和H9C2(心肌细胞)中AMPK的磷酸化,并促进其下游共激活因子pGC-1α的转录。在进一步的ATG激动AMPK活性的机制研究中,我们证明了ATG不是作为AMPK的直接激动剂来激动AMPK的活性,而是通过调控其上游通路(LKB1和CaMKK)来调控AMPK的活性。接下来我们在动物水平对ATG进行了耐力提高评价实验,结果发现：ATG能够增加小鼠肌肉组织中AMPK的磷酸化,促进解偶联蛋白3(UCP3)和细胞色素C (cytochrome C)的表达,进而提高小鼠跑台的力竭时间和距离。此外,我们还筛选了一系列针对ATG进行结构改造和优化的衍生物,最终获得了数个活性优于ATG的衍生物。在本部分工作中我们发现了天然产物ATG作为AMPK激动剂能够模拟运动训练提高小鼠跑台耐力,这为抗代谢性疾病药物的开发提供了新的研究思路以及有价值的结构信息。传统中草药罗汉果的粗提物能够有效的促进胰岛素分泌,降低血糖,但其具体的药理机制和有效成分还未清楚。我们对9个从罗汉果中提取的化合物进行了AMPK激动活性的筛选评价并得到了两个AMPK激动剂,其中一个为新化合物。这部分工作,为深入探讨罗汉果的抗糖尿病机制提供了线索,具有重要意义。在本论文第二部分中,我们开展了体内花生四烯酸代谢产物PGF2α作为LXR/RXR拮抗剂对Aβ调控的作用机制研究。阿尔茨海默症是一种以记忆损伤和认知障碍为主的神经退行性疾病,主要病理特征为脑内淀粉样蛋白β-amyloid (Ap)的沉积以及胞内神经纤维结的缠结。阿尔茨海默症死亡率较高,仅次于心脑血管疾病和癌症,是威胁老年人健康的严重疾病之一。导致阿尔茨海默症的危险因素众多,其具体的发病机制尚未清楚,因而到目前为止仍未发现能够有效治愈阿尔茨海默症的药物。前列腺素F2a (Prostaglandin F2α, PGF2α)作为体内花生四烯酸的主要代谢产物之一,在生殖生理过程中起到重要的调节作用,如：卵巢功能,子宫内膜周期变化等。此外,PGF2α还被报道与一系列急性和慢性炎症相关。在阿尔茨海默症病人的海马组织中也发现了升高的PGF2α,但是其在炎症以及阿尔茨海默症中的具体作用机制并不清楚。我们利用哺乳动物单杂交实验和转录激活实验对一系列核受体进行了筛选,最终发现PGF2α是一个内源性的Liver X receptor (LXR)和Retinoid X receptor (RXR)拮抗剂,且能够选择性的拮抗LXR/RXR和RXR/RXR二聚体,具有较好的核受体选择性。LXR能够通过激活其下游基因apolipoprotein E (apoE)的表达和脂化促进脑内Aβ的清除、减少蛋白斑块沉积、改善认知损伤；且LXR还能负调控炎症反应,降低脑内Ap引起的炎症反应。基于此,我们在小神经胶质细胞BV2中对PGF2α的拮抗LXR的促Aβ清除和抗炎作用进行了探讨。结果发现：PGF2a能够拮抗LXR激动剂(t0901317)刺激的apoE、 ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1)和ABCG1基因的转录,从而拮抗t0901317的促Ap清除作用；而且,PGF2α还能够浓度依赖的拮抗t0901317对lipopolysaccharide(LPS)和Aβ刺激引起的炎症的抑制作用。由于长时间的炎症刺激能够诱导神经细胞的凋亡,t0901317因其抗炎效应可以有效的保护细胞、抑制细胞凋亡,而PGF2α则能够拮抗t0901317的保护作用,促使神经细胞凋亡。这一工作提示我们：PGF2α可能通过拮抗LXR影响了脑内Aβ的清除以及炎症反应,从而参与了阿尔茨海默症的病理进程,为我们更好的了解阿尔茨海默症的发病机制提供了信息,也为预防和治疗阿尔茨海默症提供了新的研究思路。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
缩略词简表  12-14
第1章前言  14-35
  1.1 基于AMPK为靶标抗代谢性疾病的研究进展  14-23
    1.1.1 AMPK的结构  14-15
    1.1.2 AMPK活性调节  15-17
    1.1.3 AMPK调节细胞的能量代谢  17-19
    1.1.4 AMPK调节整体的能量平衡  19-20
    1.1.5 AMPK与代谢性疾病  20-23
  1.2 阿尔茨海默症的研究进展  23-33
    1.2.1 阿尔茨海默症简介  23-24
    1.2.2 阿尔茨海默症的致病因素  24-27
    1.2.3 阿尔茨海默症的治疗药物  27-29
    1.2.4 基于LXR为靶点的阿尔茨海默症治疗策略  29-33
  1.3 问题与展望  33-35
第2章 AMPK激动剂的发现及其相关机制研究  35-72
  2.1 引言  35-36
  2.2 材料与方法  36-42
    2.2.1 材料与试剂  37-38
    2.2.2 细胞培养及分化  38
    2.2.3 细胞瞬时转染和荧光素酶报告基因检测试验  38
    2.2.4 AMPK酶活测定试验  38-39
    2.2.5 Vector-based RNAi干扰技术  39
    2.2.6 细胞样品中RNA的抽提和反转录  39-40
    2.2.7 实时荧光定量PCR  40
    2.2.8 动物实验  40-41
    2.2.9 免疫印记实验(Western Blot)  41
    2.2.10 Western定量分析  41
    2.2.11 血清生化分析  41-42
    2.2.12 IL-6与TNF-α的测定  42
    2.2.13 数据分析  42
  2.3 实验结果  42-68
    2.3.1 ATG激活HEK293T细胞中AMPK的磷酸化  42-43
    2.3.2 ATG促进肌肉细胞中AMPK的磷酸化  43-46
    2.3.3 ATG通过激动AMPK促进PGC-1α基因的转录  46-49
    2.3.4 ATG通过依赖于CaMKK和LKB1通路激活AMPK  49-53
    2.3.5 ATG有效增加静态小鼠跑台耐力  53-56
    2.3.6 ATG增加肌肉组织中AMPK磷酸化、线粒体生物功能和脂肪酸氧化  56-59
    2.3.7 ATG衍生物活性筛选  59-63
    2.3.8 罗汉果提取物活性筛选  63-68
  2.4 讨论  68-70
  2.5 小结  70-72
第3章 PGF_(2α)作为LXR/RXR拮抗剂对Aβ调控的作用机制研究  72-101
  3.1 引言  72-73
  3.2 材料与方法  73-78
    3.2.1 材料与试剂  73-74
    3.2.2 质粒  74
    3.2.3 细胞培养  74-75
    3.2.4 pcDNA3.1A-LXRβ以及PCMX-GAL4-LXRβ-LBD克隆的构建  75
    3.2.5 转录激活实验  75
    3.2.6 哺乳动物单杂交实验  75-76
    3.2.7 细胞样品中RNA的抽提和反转录  76
    3.2.8 实时荧光定量PCR  76-77
    3.2.9 免疫印记实验(Western Blot)  77
    3.2.10 Western定量分析  77
    3.2.11 细胞活力测定  77
    3.2.12 Aβ清除实验测定  77-78
    3.2.13 数据分析  78
  3.3 实验结果  78-97
    3.3.1 PGF_(2α)是LXRα和LXRβ的内源性拮抗剂  78-83
    3.3.2 PGF_(2α)对其它核受体的选择性  83-88
    3.3.3 PGF_(2α)拮抗t0901317的促Aβ清除的作用  88-92
    3.3.4 PGF_(2α)拮抗t0901317的抗炎作用  92-97
  3.4 讨论  97-99
  3.5 小结  99-101
参考文献  101-117
发表文章及申请专利情况  117-118
致谢  118

AMPK及LXR通路新型天然调节剂的发现及相应作用机制研究

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