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OxLDL诱导巨噬细胞Nogo-B表达上调及其机制研究

作　者: 林张军
导　师: 芮耀诚
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: Nogo-B 巨噬细胞 内质网应激 自噬
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是危害人类健康最严重的疾病之一,是心脑血管疾病的病理基础。研究表明AS是一种慢性炎症反应。在AS斑块区存在大量由单核巨噬细胞和平滑肌细胞转化而来的泡沫细胞。大量数据表明泡沫细胞与斑块区的炎症、内质网应激、凋亡、自噬等密切相关。促进泡沫细胞中脂质的外排,抑制AS斑块区的炎症反应成为治疗AS斑块的可能途径。Nogo-B是Nogo (Neurite outgrowth inhibitor)的三个亚型之一,属于Reticulon (RTN)蛋白家族。RTN蛋白是一类定位于内质网上的蛋白家族,功能涉及管状内质网的形成,维持膜曲率。Nogo-B在体内分布广泛,在血管内皮细胞、平滑肌细胞以及炎症细胞中高表达。Nogo-B参与了血管损伤后的重构,促进了内皮细胞的迁移和炎症细胞的募集。在AS斑块区Nogo-B水平随着斑块发展逐渐降低,这可能促进了AS进程。尽管斑块区Nogo-B整体水平下降,但是Nogo-B依然在斑块区巨噬细胞中高表达。斑块区巨噬细胞不断吞噬修饰的低密度脂蛋白,尤其是氧化的低密度脂蛋白,导致细胞中大量脂质堆积而逐步泡沫化,促进了斑块的发展。然而Nogo-B在巨噬细胞泡沫化进程中发挥的作用还不清楚。我们利用oxLDL体外刺激巨噬细胞形成泡沫细胞模型,研究了Nogo-B在巨噬细胞和泡沫细胞中发挥的功能,从内质网应激和自噬的角度阐述了Nogo-B的抗AS作用。方法与结果：为了研究oxLDL对Nogo-B表达的影响,我们利用oxLDL刺激巨噬细胞形成泡沫细胞,运用Western blot及Realtime PCR法检测Nogo-B蛋白以及mRNA的表达,结果表明oxLDL提高了小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中Nogo-B mRNA和蛋白水平。为了寻找oxLDL诱导Nogo-B上调的机制,我们利用ATF-6siRNA干扰ATF-6的表达,检测ATF-6knockdown之后对oxLDL诱导的Nogo-B表达的影响。首先利用免疫荧光技术检测了内质网应激激活因子ATF-6,发现oxLDL诱导了RAW264.7细胞内ATF-6激活。接着利用siRNA干扰ATF-6的表达后,给予oxLDL刺激,我们发现oxLDL不能诱导ATF-6knockdown细胞中Nogo-B的表达,表明oxLDL诱导的Nogo-B表达上调是通过ATF-6介导的。为了检测Nogo-B上调与内质网应激的关系,我们利用siRNA干扰Nogo-B的表达后,再给予oxLDL刺激,比较对照组与Nogo knockdown组内质网应激水平。Nogo knockdown组内质网应激相关蛋白PERK、eIF2α、JNK磷酸化水平均上升。表明Nogo-Bknockdown增强了oxLDL诱导的内质网应激。OxLDL刺激RAW264.7细胞24h后,细胞中出现较强的自噬水平,LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1水平上升。免疫荧光结果也显示oxLDL刺激后的细胞中出现较多的LC3荧光点。利用siRNA干扰Nogo-B的表达后,给予oxLDL诱导自噬,比较Nogo knockdown细胞与对照组细胞自噬水平的差异。透射电镜结果显示Nogo knockdown细胞中自噬泡增多。Western blot结果显示Nogo knockdown提高了LC3-II和p62蛋白水平,但是添加氯喹处理后LC3-II变化不明显,表明LC3-II增多可能是自噬溶酶体降解途径受阻。为了进一步确定p62蛋白升高的原因是自噬性降解受到抑制还是蛋白表达增多,我们检测了oxLDL刺激后的细胞中p62蛋白以及p62mRNA水平的变化。Western blot和Realtime PCR结果显示,随着oxLDL刺激时间的增加,Nogo knockdown组p62蛋白水平均明显高于对照组,而p62mRNA水平没有明显差异。这一现象表明Nogo knockdown抑制了p62的降解。我们又分析了Nogo-B knockdown对细胞基础白噬水平的影响,Nogo-B knockdown组细胞中p62水平以及LC3-II水平略高于对照组,给予氯喹处理后,随着刺激时间的延长,两组间p62水平和LC3-II水平没有明显差异。表明Nogo knockdown也影响了细胞基础自噬。利用流式细胞检测技术比较Nogo knockdown是否影响了巨噬细胞对DiI-oxLDL的吞噬能力,Nogo knockdown巨噬细胞对DiI-oxLDL的吞噬能力与对照组相比没有显著差异。RAW264.7细胞吞噬DiI-oxLDL12h后,再利用3-MA和Rapamycin处理12h,激光共聚焦显微镜下观察到3-MA处理后的细胞内荧光颗粒明显多于对照组,而Rapamycin处理后细胞内荧光明显弱于对照组,表明自噬促进了细胞内脂质的清除。我们发现Nogo knockdown组细胞内荧光颗粒也多于对照组细胞,而且Nogo knockdown细胞中脂滴表面特异蛋白Adipophilin蛋白水平明显高于对照组,表明Nogo knockdown抑制了泡沫细胞内脂质的清除。巨噬细胞过表达Nogo-B之后,给予oxLDL刺激24h, Nogo-B过表达的细胞中Adipophilin蛋白水平明显低于对照组。同时p62轻微下调,但LC3蛋白水平明显下降,提示Nogo-B可能促进了自噬体的成熟,而不是激活自噬。免疫荧光显示细胞内大量脂质负荷时,LC3与细胞内脂质存在共定位,表明自噬参与了细胞内脂质的降解。同时细胞中内源性的Nogo-B和外源性的Nogo-B与细胞内脂质均存在共定位,但是随着细胞内脂质的减少,Nogo-B与脂滴共定位现象逐渐消失,表明Nogo-B参与了脂滴的自噬性降解。结论：1、OxLDL可诱导巨噬细胞发生内质网应激,而激活的ATF-6介导了Nogo-B的表达。2、Nogo-B参与了巨噬细胞中自噬溶酶体降解途径,促进了巨噬细胞中脂质的清除,从而抑制了巨噬细胞向泡沫细胞的转变。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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