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CUEDC2调控巨噬细胞功能的机制研究

作　者: 陈媛
导　师: 张学敏; 李涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 巨噬细胞 CUEDC2 炎症炎性肠病
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

单核-巨噬细胞（monocyte-macrophage）是机体重要的免疫细胞，是机体固有免疫的重要组成部分。巨噬细胞（Macrophage）由单核细胞（Monocyte）分化而来，负责抗原递呈并分泌炎性介质，发挥着免疫防御与监视的功能。另一方面，大量研究表明巨噬细胞的功能异常导致了各种自身免疫疾病和肿瘤的发生，因此深入研究巨噬细胞的功能调控机制是我们认识肿瘤，特别是炎症诱发肿瘤等疾病发生的机制并进行有效治疗的前提。CUEDC2（GeneBank：NM₀24040）是一个包含CUE结构域的功能未知蛋白质。本实验室前期工作发现CUEDC2通过招募GADD34和PP1使IKK复合体去磷酸化，通过对PP1招募实现对IKK激活的抑制，进而实现对NF-B信号通路激活的调节。最近，本实验室发现CUEDC2蛋白质在肿瘤细胞中广泛高表达，研究表明CUEDC2参与调节细胞有丝分裂纺锤体检查点的灭活，通过促进纺锤体检查点的过早关闭，造成基因组不稳定发生并促进肿瘤形成。此外，CUEDC2的表达水平还与乳腺癌患者的预后密切相关，CUEDC2能够通过降解雌激素受体ER导致乳腺癌患者对他莫昔芬治疗产生耐药。该分子还通过与SOCS3的相互作用，抑制STAT3磷酸化和其转录活性，参与JAK1/STAT3信号负调控过程。因此，CUEDC2与炎症和肿瘤的发生都密切相关，深入研究CUEDC2在免疫和炎症中的功能，将可能为揭示“炎症诱发肿瘤”的机制提供重要的线索。本项研究主要是因为下述重要线索而开展：我们发现在巨噬细胞的分化过程中，CUEDC2蛋白质的表达量显著增加，而且该分子的缺失对巨噬细胞的功能产生了重要影响。在深入开展的研究中，我们在CUEDC2基因敲除小鼠巨噬细胞和人原代巨噬细胞中都验证了上述发现，并发现miR-324-5p调控CUEDC2分子上调的机制。在进一步的研究中，我们发现，无论是CUEDC2敲低的人原代巨噬细胞，还是CUEDC2基因敲除的小鼠巨噬细胞，在LPS等炎性刺激情况下， IL-6、TNF等炎性因子的表达水平显著升高，显示了巨噬细胞在CUEDC2缺失情况下的过度激活；相反，提高CUEDC2表达能够抑制巨噬细胞的激活。我们随后在动物整体水平进行了更深入的研究，发现在LPS刺激时，CUEDC2敲除小鼠的巨噬细胞确实过度激活，敲除小鼠较野生型小鼠显现了显著增强的炎症反应。此外，在葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium, DSS）诱导的炎性肠病中（Inflammatory bowel disease, IBD），我们进一步发现CUEDC2敲除小鼠无论在发生肠炎的范围和程度上均显著增强，显示CUEDC2是参与炎症强度调控的一个重要蛋白质分子。综上所述，我们发现了一个调控巨噬细胞功能的重要因子—CUEDC2。CUEDC2能够调控巨噬细胞炎性激活的强度，使机体免于因过度炎症反应导致自身免疫疾病的发生，而CUEDC2的缺失导致巨噬细胞的过度激活以及机体严重的炎症反应。因此，稳定CUEDC2分子将可能成为治疗自身免疫性疾病的一项新策略。

全文目录

缩略词表  5-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-15
材料与方法  15-23
  1. 材料及来源  15-16
    1.1. 细胞培养  15
    1.2. 动物培养  15-16
  2. 主要试剂  16-17
  3. 实验方法  17-23
    3.1. 人原代单核细胞分离、纯化以及体外培养  17-18
    3.2. 小鼠巨噬细胞分离以及体外培养  18-19
    3.3. 原代巨噬细胞siRNA和microRNA转染  19
    3.4. 腺病毒介导的外源基因在原代巨噬细胞中表达  19
    3.5. 炎性因子实时荧光定量PCR检测  19-21
    3.6. microRNA丰度检测  21-22
    3.7. 血清炎性因子检测- ELSIA  22
    3.8. 小鼠炎性肠病模型建立以及评价  22-23
实验结果  23-45
  1. 单核-巨噬细胞分化过程中 CUEDC2 表达水平显著上调  23-25
    1.1 人原代巨噬细胞分化过程中 CUEDC2 表达显著上调  23-24
    1.2 小鼠原代巨噬细胞分化过程中 CUEDC2 表达显著上调  24-25
  2. 单核-巨噬细胞分化过程中 CUEDC2 的表达受 microRNA 调控  25-30
    2.1 CUEDC2 在单核细胞分化过程中的上调是转录后调控  25-26
    2.2 生物信息学预测得到调控 CUEDC2 的 microRNA-324-5p  26-28
    2.3 miR-324-5p 在单核-巨噬细胞分化过程中表达水平下调  28-29
    2.4 miR-324-5p 抑制细胞中 CUEDC2 的表达量  29-30
  3. CUEDC2 缺失的巨噬细胞对炎性刺激反应过度  30-33
    3.1 CUEDC2 敲除小鼠巨噬细胞对炎性刺激反应过度  30-31
    3.2 人巨噬细胞中敲低 CUEDC2 使其对炎性刺激更加敏感  31-33
  4. 过表达 CUEDC2 抑制巨噬细胞的炎性激活  33-35
    4.1 人原代巨噬细胞中过表达 CUEDC2 抑制巨噬细胞炎性激活  33-34
    4.2 鼠原代巨噬细胞中过表达 CUEDC2 抑制巨噬细胞炎性激活  34-35
  5. CUEDC2 敲除小鼠对 LPS 刺激的响应  35-38
    5.1 血清炎性因子分泌水平变化  36
    5.2 腹腔巨噬细胞炎性因子表达水平变化  36-37
    5.3 脾脏炎性因子水平变化  37-38
  6. CUEDC2 敲除小鼠对 DSS 诱导的炎性肠病易感  38-45
    6.1 CUEDC2 敲除小鼠结肠溃疡程度严重  39-40
    6.2 CUEDC2 敲除小鼠结肠水肿程度严重  40-41
    6.3 CUEDC2 敲除小鼠在停药后持续腹泻  41-42
    6.4 CUEDC2 敲除小鼠停药后直肠出血严重  42-43
    6.5 CUEDC2 敲除小鼠体重下降显著  43-45
讨论  45-48
结论  48-49
附表  49-51
参考文献  51-58
综述  58-74
  参考文献  68-74
发表文章一  74-81
发表文章二  81-87
个人简历  87-88
致谢  88-89

CUEDC2调控巨噬细胞功能的机制研究

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