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西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6影响及机制探讨

作　者: 李锋进
导　师: 李志樑
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 西洛他唑脂多糖人THP-1单核细胞白介素6
分类号: R541.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)指冠状动脉粥样硬化使血管官腔狭窄或阻塞,或(和)因冠脉功能性改变(痉挛)导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病,简称冠心病(coronary heart disease, CHD)。冠心病是严重危害人类生命健康的常见病,进入二十一世纪以来,随着老年人口比例增加,人口老年化,并且高盐高脂饮食、肥胖人口的增多及生活节奏的紧张使冠心病患者日趋“年青化”,至此冠心病的患病率和病死率呈现明显上升趋势。有关冠心病发病机制的研究一直是全世界关注的重点和热点,但其机制仍尚不明确,成为冠心病防治进展的主要难点。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病发病的主要病理基础。研究表明,动脉粥样硬化是由多种因素作用于不同环节所致,而这些因素称为危险因素,主要的危险因素如高龄、血脂升高、吸烟、血压升高、血糖升高、高半胱氨酸血症以及高尿酸血症等。这些危险因素在一定程度上促进了动脉粥样硬化发生和发展。以往和近年来提出关于动脉粥样硬化发病学说,如脂质浸润学说、内皮损伤反应学说、血栓形成学说、平滑肌细胞单克隆学说、同型半胱氨酸学说、精氨酸学说、内皮功能紊乱学说、氧化应激学说等均不足以完全解释AS性疾病的发病基础。然而,近年大量研究证实,炎症反应已被公认为动脉粥样硬化形成的机制：动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,同其它炎症一样,AS也具有炎症的基本病理特征：变性、渗出和增生。随着研究的进一步深入,发现AS不仅是血管局部炎症病变,还是多种免疫细胞异常导致的全身免疫紊乱。在动脉粥样硬化病变发生发展过程中,从开始的脂质条纹到纤维斑块和粥样斑块甚至不稳定斑块的生成、破裂和血栓形成,各种炎症细胞和多种炎症介质参与其中.冠状动脉局部或全身的炎症反应在动脉粥样硬化的发生、发展过程及其所致的并发症中起着重要作用。研究证实,动脉粥样硬化斑块不稳定的主要因素可能与炎症反应的激活有关。单核-巨噬细胞(mononuclear macrophage)是重要的免疫细胞,是动脉粥样硬化形成过程中最常见的炎症细胞,是AS斑块重要组成部分,同时也是易损斑块形成的重要病理生理学基础。正常情况下,血管内皮细胞能阻止白细胞聚集并可以促进纤维蛋白的溶解。当内皮细胞受到高脂血症、高血压、糖尿病、吸烟、肥胖以及炎症等刺激因素时,会导致初始的血管炎症损伤并产生的炎症细胞因子可吸引单核细胞到达损伤局部并进入动脉内膜下间隙,即成熟为巨噬细胞,并吞噬血管内膜的脂蛋白形成泡沫细胞,粥样斑块初步成形。单核—巨噬细胞将外源性抗原递呈给T淋巴细胞,激活获得性免疫系统,加重血管炎性病变。同时巨噬细胞还分泌组织因子和金属蛋白酶,使动脉内膜的细胞外基质溶解,从而导致斑块纤维帽的消化和斑块破裂。As斑块中的单核-巨噬细胞分泌多种炎性细胞因子,如IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和TNF-α,进一步加剧单核细胞聚集、巨噬细胞的增殖以及平滑肌细胞的迁移、增殖,促使As斑块不断进展。另外更有证据表明在急性冠状动脉综合症(ACS)中炎症反应不仅局限于病灶部位甚至越过血管床扩散,并伴有IL-6、CRP等炎症标志物水平的增高和全身循环中白细胞激活。研究表明,动脉粥样硬化斑块中的单核细胞受刺激后可分泌的IL-6是炎症反应的一个中枢性调节因子,在冠心病的血管损伤和急性心肌缺血中发挥着关键作用。脂多糖(LPs),也称作细菌内毒素,是构成革兰氏阴性细菌细胞外壁的主要成分。脂多糖可以从活菌体上缓慢释放,当菌体破碎后大量释放到周围环境中。脂多糖是一种两亲的分子,包括一个疏水性的磷脂部分(磷脂A),构成细菌外膜最外面的部分,其亲水部分为多糖部分,伸出到菌体的外面。脂多糖分子上的脂类部分和多糖部分都参与脂多糖的生物活性。不同细菌的完整脂多糖可以特异性地结合在人单核细胞和巨噬细胞表面.脂多糖引起的炎症反应是由其与宿主细胞的相互作用所引起的,机体对脂多糖的敏感性是由可溶性的以及细胞表面的结合蛋白质介导和调节的。LPS介导的炎症过程研究发现其主要是诱导致炎症因子如白介素、单细胞趋化蛋白、氧自由基等大量表达,以致促进炎症和抵抗炎症系统之间失衡,从而产生炎症。白介素细胞-6(interleukin6, IL-6)又称前炎症细胞因子,可通过体液和细胞免疫功能影响炎症、组织损伤和宿主防御。IL-6是一种多功能的细胞因子,产生于血管内皮细胞、活化T淋巴细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞等。目前认为IL-6可能通过多种途径参与冠脉粥样硬化(AS)的形成与进展,例如IL-6促进巨噬细胞表面LDL受体的合成及其对LDL的摄取,促进粥样斑块形成；IL-6可刺激巨噬细胞分泌单核细胞趋化蛋白,促使单核细胞聚集进入血管内皮下参与斑块形成；IL-6以自分泌方式刺激血管平滑肌细胞增生；IL-6可诱导肝细胞产生血浆纤溶酶原激活物抑制物(PAI)以及肝脏产生急性期反应蛋白,促进冠状动脉血栓形成。研究发现,IL-6可刺激斑块中平滑肌细胞的增殖从而导致斑块破裂。IL-6是AS及其他心血管疾病重要的预测因子,IL-6水平的高低与疾病的预后及心血管事件的再发生紧密相关。从AS患者冠状动脉提取的旋磨斑块中发现,IL6表达明显增加,提示IL-6与不稳定斑块密切相关,可知血浆IL-6值的升高对患者ACS的发生有预测价值。Rus HG等研究发现,60%不稳定心绞痛患者中血循环IL-6增高,而稳定性心绞痛患者却无明显变化。进一步研究发现升高的IL-6水平预示不稳定性斑块的存在,也预示发生心肌梗死的危险性增高。西洛他唑(cilostazol)是一种新型抗血小板药物,属于磷酸二酯酶抑制剂,可逆、选择性抑制磷酸二酯酶活性和阻断cAMP降解,同时抑制腺苷的摄取,能抑制血小板聚集及血管扩张。西洛他唑具有预防动脉粥样硬化、抗动脉血栓形成和进行性血管狭窄的功能,可广泛用于糖尿病并发症的治疗,还可以调节血脂及扩张动脉血管,起到稳定斑块作用,在缺血性脑卒中的二级预防中有明确抗血小扳聚集作用,且还有改善血管内皮功能及降低出血风险。近年来研究发现,支架植入术(PCI)后应用西洛他唑可减少新生内膜增生和重构,有抗晚期再狭窄作用,但西洛他唑抗A s发生发展及可能的作用机制目前尚不清楚.Lee等研究发现,西洛他唑能减小低密度脂蛋白(LDL)受体缺陷小鼠动脉粥样硬化的面积而且减少TNF-a的合成,同时减少斑块局部巨噬细胞的聚集,MCP-1下降。体外试验表明,西洛他唑抑制THP-1单核细胞内MCP-1和MMP-9的mRNA表达,这些机制可能与减少炎症有关。另一项研究也表明,西洛他唑能抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-6及TNF-a的合成,这种作用是通过抑制NF-KB活性所致,从而起到抗粥样硬化作用,在冠心病治疗中起重要作用。单核-巨噬细胞是是动脉粥样硬化形成过程中最常见的炎症细胞,同时也是易损斑块形成的重要病理生理学基础,不但在动脉粥样硬化起始和进展中发挥关键作用,还在斑块破裂和血栓形成中也扮演着重要角色。动脉粥样硬化斑块中的单核细胞受刺激后可分泌的IL-6是炎症反应的一个中枢性调节因子,在冠心病的血管损伤和急性心肌缺血中发挥着关键作用。西洛他唑是一种新型抗血小板药物,不仅具有抗血小板聚集,还能促进动脉扩张,抑制平滑肌细胞增殖和内膜增厚。西洛他唑在预防和治疗冠心病中起着重要作用,但西洛他唑抗动脉粥硬化样的作用机制尚不明确。西洛他唑是否对LPS诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6有影响,其中作用机制又是如何。本课题分为两个部分,将体外培养人THP-1单核细胞作为研究对象,实验分为对照组、LPS组、西洛他唑低溶度组、西洛他唑中溶度组以及西洛他唑高浓度组,西洛他唑组加入不同溶度(10,20,40μmol/L)干预12h加入LPS刺激24h。(1)应用ELISA法检测各组细胞培养上清IL-6水平,观察IL-6水平的变化,探讨西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6影响。(2)应用Western blot检测各组细胞浆IκBα及细胞核NF-κB P65的表达,观察IκBα及细胞核NF-κBP65的表达的变化,探讨西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6的机制。旨在为临床冠心病治疗合理用药提供基础研究依据。结果分述如下：1.西洛他唑能抑制LPS诱导的人THP-1单核细胞白介素6的合成1.1西洛他唑不同浓度干预人THP-1单核细胞以人THP-1单核细胞为实验对象,实验分为五组,空白对照组,LPS组,西洛他唑低浓度组(LPS100μg/L+西洛他唑10μmol/L),西洛他唑中浓度组(LPS100μg/L+西洛他唑20μmol/L),西洛他唑高浓度组(LPS100μg/L+西洛他唑40μmol/L),实验组加入不同浓度西洛他唑干预12h,再给予终浓度为100μg/L的LPS作用24h。1.2CCK—8检测药物对细胞的增殖活性影响西洛他唑预干预12小时,再加入LPS联合作用24小时后,与对照组相比较,西洛他唑10μmol/L、20μmol/L、40nmol/L加LPS100μg/L联合作用对细胞生存率无显著影响(P>0.05),而西洛他唑80nmol/LL加LPS100μg/L联合作用对细胞有显著影响(P<0.05)。1.3酶联免疫吸附试验(ELISA),检测IL-6水平不同浓度西洛他唑均能抑制LPS100μg/L诱导人THP-1单核细胞合成白介素6,随着剂量的增加,这种抑制作用越加明显,当西洛他唑剂量达40μmol/L,抑制作用最大,与LPS组相比差异均有显著性(P<0.05)。2.西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞浆蛋白IκBα及核蛋白NF-κB P65水平影响2.1Western blot检测细胞浆蛋白IκBα及细胞核蛋白NF-κBP65表达对照组人单核细胞浆蛋白IκBα水平最高,而核蛋白NF-κB P65水平最低,LPS组人单核细胞浆蛋白IκBα最低,而核蛋白NF-κB P65水平最高(P<0.05)。加入西洛他唑预干预12h,西洛他唑可抑制LPS所致的人TPH-1单核细胞浆蛋白IκBα水平的下降及核蛋白NF-κB P65水平的增加,随浓度增加,这种抑制作用越强,差异有显著性(P<0.05)。通过上述两个部分的实验,我们能够得出以下结论：①西洛他唑呈浓度依赖性地抑制LPS诱导的人THP-1单核细胞IL-6的合成。②西洛他唑抑制LPS诱导的人THP-1单核细胞IL-6的合成,可能是通过减少细胞活化过程中IκBα的降解及P65从胞质向核内转位从而抑制NF-κB活化实现的。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-21
第一部分西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6影响的实验研究  21-33
  1.1 材料与方法  22-26
  1.2 结果  26-28
  1.3 讨论  28-30
  1.4 参考文献  30-33
第二部分西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6影响的机制研究  33-48
  2.1 材料与方法  34-39
  2.2 结果  39-41
  2.3 讨论  41-44
  2.4 参考文献  44-48
结论  48-49
附录  49-51
文献综述  51-60
  参考文献  56-60
攻读学位期间成果  60-61
致谢  61-62

西洛他唑对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞分泌IL-6影响及机制探讨

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