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动物内源性多肽CGA-N46抗菌谱的测定及其对细胞膜的作用

作　者: 卢研博
导　师: 李瑞芳
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: CGA-N46 纯化抗菌谱跨膜机制
分类号: R519
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

真菌病是病原真菌侵袭机体引起的疾病,多感染免疫力低下人群。CGA-N46是一种由嗜铬粒蛋白N端衍生出来的新型抗真菌多肽。本实验通过对发酵液分离纯化得到纯度较高的CGA-N46,并研究其抗菌谱及对细胞膜的作用,为将其开发成为新型抗真菌药物奠定理论基础。利用生物信息学软件分析CGA-N46的氨基酸序列,发现CGA-N46等电点为7.38,分子量为5363.1；CGA-N46为亲水蛋白,在哺乳动物、酵母中的半衰期都大于20小时；二级结构为α-螺旋；有两个磷酸化位点,无跨膜区、信号肽和糖基化位点；其进入细胞后主要分布于细胞核(52.2%),其他依次为细胞质(26.1%)、细胞骨架(17.4%)和线粒体(4.3%)。对CGA-N46进行基因工程诱导表达,将发酵液通过硫酸铵盐析、硅胶吸附层析、等电点沉淀和葡聚糖凝胶层析,最终得到纯度为82.7%的CGA-N46。采用液体静置培养法,验证了纯化后的CGA-N46仍保持有较高的抑制白念珠菌生长的活性。通过微量稀释法,获得了CGA-N46抗菌谱。研究结果表明,CGA-N46对白念珠菌(Candida albicans)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)和热带念珠菌(Candida tropicalis)具有抑制效果,其中对克柔念珠菌最敏感,其MIC50为500ug/mL。研究了CGA-N46穿膜过程中对细胞膜的影响。运用LB拉膜技术研究CGA-N46对卵磷脂成膜π-A曲线的影响,结果表明,随着CGA-N46浓度的增加,卵磷脂在成膜过程中单分子占有面积不断增加,排列越来越不规则,卵磷脂成膜稳定性降低。通过PI荧光染色法和测定克柔念珠菌外渗液电导法证明,随着CGA-N46浓度的增加和作用时间的增长,克柔念珠菌细胞膜通透性没有增大。因此,CGA-N46可能是通过降低细胞膜的稳定性、破坏细胞膜的形态而穿过细胞膜的。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
第一章前言  11-21
  1.1 真菌病流行现状  11-12
  1.2 抗真菌药物  12-13
  1.3 抗菌肽简介  13-18
    1.3.1 抗菌肽的发现  14
    1.3.2 抗菌肽的结构  14
    1.3.3 抗菌肽的作用机制  14-18
      1.3.3.1 对细胞壁的影响  15
      1.3.3.2 对细胞膜的影响  15-17
      1.3.3.3 对线粒体的破坏作用  17
      1.3.3.4 对细胞核DNA的影响  17-18
      1.3.3.5 对膜蛋白的影响  18
    1.3.4 抗菌肽的局限性  18
  1.4 CGA-N46研究进展  18-19
    1.4.1 嗜铬粒蛋白  18-19
    1.4.2 嗜铬粒蛋白A  19
    1.4.3 CGA-N46  19
  1.5 本论文的研究目的和内容  19-21
    1.5.1 研究目的  19
    1.5.2 研究内容  19-21
第二章实验材料和方法  21-36
  2.1 实验材料  21-27
    2.1.1 CGA-N46核酸序列  21
    2.1.2 软件和工具  21
    2.1.3 质粒和菌种  21-22
    2.1.4 主要试剂  22-23
    2.1.5 培养基  23
    2.1.6 主要溶液  23-26
    2.1.7 主要仪器  26-27
  2.2 实验方法  27-36
    2.2.1 CGA-N46的生物信息学分析  27
      2.2.1.1 CGA-N46理化性质分析  27
      2.2.1.2 CGA-N46二级结构预测  27
      2.2.1.3 CGA-N46跨膜区和信号肽分析  27
      2.2.1.4 CGA-N46进入细胞后的细胞内定位  27
      2.2.1.5 CGA-N46糖基化和磷酸化位点分析  27
      2.2.1.6 CGA-N46三维空间结构分析  27
    2.2.2 枯草杆菌转化  27-28
    2.2.3 CGA-N46在枯草杆菌DB1342(p-3N46)中的诱导表达  28
    2.2.4 CGA-N46的分离纯化  28-31
      2.2.4.1 发酵液的收集  28
      2.2.4.2 硫酸铵盐析  28
      2.2.4.3 硅胶吸附层析  28-29
      2.2.4.4 等电点沉淀  29-30
      2.2.4.5 Sephadex G-50层析  30-31
    2.2.5 分离小分子蛋白的SDS-PAGE  31
    2.2.6 CGA-N46的抗真菌活性实验  31-32
    2.2.7 真菌的培养  32
    2.2.8 真菌孢子悬液的制备  32-33
    2.2.9 CGA-N46抗菌谱的测定  33-34
    2.2.10 CGA-N46对细胞膜的作用研究  34-36
      2.2.10.1 CGA-N46对卵磷脂成膜π-A曲线的影响  34
      2.2.10.2 CGA-N46对敏感菌细胞膜通透性的影响  34-36
第三章结果与分析  36-60
  3.1 CGA-N46的生物信息学分析  36-40
    3.1.1 CGA-N46的理化性质  36-37
    3.1.2 CGA-N46的二级结构  37-38
    3.1.3 CGA-N46的跨膜区和信号肽预测  38-39
    3.1.4 CGA-N46在细胞内的定位  39
    3.1.5 CGA-N46糖基化位点和磷酸化位点预测  39-40
    3.1.6 CGA-N46三维空间结构  40
  3.2 CGA-N46的分离纯化与抗菌活性结果  40-46
    3.2.1 硫酸铵盐析  40-41
    3.2.2 硅胶吸附层析  41-43
    3.2.3 等电点沉淀  43-44
    3.2.4 Sephadex G-50层析  44-45
    3.2.5 CGA-N46的抗真菌活性  45-46
  3.3 CGA-N46的抗菌谱  46-51
  3.4 CGA-N46对细胞膜作用机制的研究  51-60
    3.4.1 LB技术检测CGA-N46对细胞膜稳定性的影响  51-53
      3.4.1.1 LB技术检测卵磷脂成膜π-A曲线  51-52
      3.4.1.2 CGA-N46浓度对卵磷脂成膜π-A曲线的影响  52-53
    3.4.2 PI荧光标记检测CGA-N46对克柔念珠菌细胞膜通透性的影响  53-59
    3.4.3 CGA-N46作用下克柔念珠菌外渗液电导率的测定  59-60
第四章讨论  60-62
  4.1 CGA-N46作用机制预测  60
  4.2 CGA-N46抗菌谱的测定方法  60-61
  4.3 CGA-N46的跨膜机制  61-62
第五章结论  62-63
参考文献  63-68
致谢  68-69
个人简历  69

动物内源性多肽CGA-N46抗菌谱的测定及其对细胞膜的作用

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