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aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩研究

作　者: 蔡进奎
导　师: 周初松
学　校: 南方医科大学
专　业: 外科学
关键词: MSCs 酸性成纤维细胞生长因子(aFGF) 基因转染载体构建运动终板肌萎缩基因表达
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

[研究背景]大量研究发现肌细胞正常结构与功能维持需要靠一些神经营养因子的作用。运动神经损伤后,骨骼肌失神经支配最大变化便是这种神经营养因子丢失,同时骨骼肌废用性萎缩,最终导致肌肉形态结构和生理生化等方面改变,组织形态学上表现为运动终板退变、肌细胞浆丢失、直径减小,并随时间延长而逐渐加重。目前关于运动神经损伤后功能重建主要还是集中在恢复神经连续性上,忽视了对其靶器官的保护,由于神经漫长的再生过程、再生过程中神经出现再退变、损伤部位阻挡因素、修复后肢体固定等原因,即使及时修复神经,肌肉失神经支配时间仍然很长,神经对肌肉的营养作用丧失,运动终板逐渐退变,给神经肌肉接头重建带来极大的困难。临床常见肌肉呈念珠状变性、横纹消失,肌肉萎缩,时间过长肌肉坏死、消失,而且肌肉失用、萎缩亦会影响运动终板的形态,二者之间形成恶性循环,成为目前严重阻碍运动神经修复后功能恢复的最重要因素之一,由此导致的肢体伤残严重损害患者的身心健康及劳动能力,给个人、家庭、社会带来沉重的负担。因此,致力于精确修复神经、促进神经生长同时应采取有效措施预防运动终板退变及肌萎缩已成为共识,如何预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩已成为当前运动神经损伤后功能重建过程中急需解决的难题。近年来为了防止或延缓失神经支配后运动终板退变及肌萎缩,提高周围神经损伤的疗效,国内外学者从多个角度对其开展了研究,创造出一系列方法,包括：①被动锻炼；②神经纤维、神经元肌肉内植入；③脉冲式磁疗、电刺激；④药物：各种神经生长因子、激素等。被动锻炼是临床上最常用的方法,有研究证实,采取被动活动能促使瘫痪肌肉被动性缩短和拉长,这样做一方面促进了肌肉血液循环,减轻组织水肿,缩短了血液中氧和营养物质与肌细胞间的弥散距离,另一方面通过机械性肌纤维拉长与缩短,使肌肉保持一定弹性,防止关节僵硬、废用性骨质疏松与肌萎缩,为再生的神经纤维到达靶器官做准备,但临床上实现常会遇见一些困难,如修复神经早期、骨折早期等常需施行早期固定肢体,加之患者长期被动锻炼难以持久配合,常造成退变不可避免[4-6]。脉冲磁疗、电刺激预防终板退变及肌萎缩观点被越来越多临床医生接受,并把电刺激、磁疗逐渐应用于临床。Shimada、Boonyarom等发现磁疗、电刺激可明显减轻神经损伤后肌细胞的凋亡、增加Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维直径、减缓肌肉重量的减轻,从而延缓运动终板退变及肌萎缩。但由于设备难以普及、临床疗效缓慢且不确切等原因,临床上推广并不顺利。近年在药物研究方面取得了一些显著成果：国内外研究显示神经断端间应用神经生长因子(NGF)或肝细胞生长因子(HGF)可减轻运动终板退变,其作用机理可能通过轴浆运输与靶器官相应受体结合来实现,然而神经断端间应用药物仅适应于Seddon分类Ⅲ度神经损伤,对适合于非手术疗法治疗者或Seddon分类Ⅰ、Ⅱ度神经损伤无法采用,且神经断端间使用缓释系统难度大,无法保证药物的长效作用,研究前景暗淡[10-15]。口服氨哮素可以防止失神经支配后运动终板退变、肌肉萎缩,其作用可能是通过某种途径使MSCs产生一种胰岛素样生长因子(IGF)的营养物质模仿神经对肌肉的营养作用。有作者报道地塞米松有保护膜性结构的作用,大鼠腹腔注射可以减缓非离断性损伤神经支配运动终板的退变,但地塞米松系激素类药物,长期应用副作用明显,仅限于实验研究,不宜长期应用于神经损伤患者,临床应用前景暗淡。基因治疗是近年来一门新兴学科,它是指将外源基因导入靶细胞并有效表达,通过移植靶细胞达到治疗疾病目的。基因治疗常常需要借用干细胞来携带外源基因,MSCs就是常用干细胞之一,它于1961年就被Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现,是一种具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞或肌源性干细胞,在出生后骨骼肌损伤修复和维持中起着重要的作用。有研究报道：肌肉失神经支配后初期MSCs数量增加,但以后其数量明显降低、体积缩小,长期失神经支配MSCs增生潜力显著降低,MSCs数量逐渐减少,部分研究认为这种进行性降低是由于失神经支配状态下MSCs发生了凋亡,因为神经的营养作用对维持MSCs含量和功能是非常重要。Viguie等推测其下降的原因为：长期失神经支配MSCs凋亡后无再生替代、MSCs合并到萎缩或新生肌纤维中的速度快于其增殖的速度。根据这一变化,许多学者认为MSCs数量的逐渐减少是影响长期失神经支配后骨骼肌功能恢复的一个重要原因。人们通过对骨骼肌再生过程研究发现,生长因子参与MSCs不同细胞周期的调节。利用细胞培养技术,已经检测出多种生长因子影响MSCs的生长调节,它们或者单独作用,或者多种细胞因子联合作用,研究较多的有以下几种生长因子：体外培养发现,IGF(胰岛素样生长因子)-Ⅰ和IGF-Ⅱ可以增加MSCs的增殖和分化,给细胞注射IGF-Ⅰ,可促进MSCs增殖和肌肉数量的增加肝细胞生长因子(HGF)对MSCs的调节作用表现在多个方面,包括作为一个潜在的趋化因子、MSCs的激活因子和成纤维细胞分化的抑制因子,HGF能激活和有选择性地促使MSCs增殖；Yablonka-Reuveni等证实FGF可促进幼年鼠及成年鼠MSCs增殖；McFarland等在对MSCs培养中发现FGF家族对MSCs增殖的详细作用,在FGF家族9种常见亚型中,FGF-1(即aFGF)、FGF-2、FGF-4、FGF-6和FGF-9被证实可以刺激MSCs增殖,同时HGF和FGF-2、FGF-4、FGF-6或FGF-9的协同作用,能提高增殖效率。Kastner, Dong等也在不同时期分别报道aFGF能促进MSCs增殖和分裂,本课题组在前期aFGF蛋白缓释系统保护运动终板及预防肌萎缩亦观察到aFGF具有维持MSCs数量作。基于以上理论和实验基础,我们认为MSCs与aFGF二者关系密切,拟行aFGF基因转染MSCs,然后通过移植来预防运动终板退变及肌萎缩,目的在于持久有效维持失神经支配期间骨骼肌神经营养作用,同时稳定骨骼肌MSCs数量,试图从根本上有效预防运动终板退变及肌萎缩,从而提高运动神经损伤修复效果。[目的]1.探索MSCs分离、纯化、培养及鉴定方法。2.探讨aFGF基因转染MSCs方法,检测其表达情况。3.研究移植aFGF基因转染的MSCs预防失神经支配运动终板退变及肌萎缩作用。[方法]1.MSCs分离、培养及鉴定：取Wister成年大鼠后肢肌肉,两步酶消化法结合差速贴壁培养法分离纯化MSCs,观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定；2.真核表达载体构建：提取人类肌肉组织总RNA,RT-PCR法调取aFGF基因,然后用无模板自扩增技术合成人类白细胞介素2信号肽序列(signal peptide sequence, SPS),通过基因融合得到SPS-aFGF,再通过定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,最终得到重组质粒PEGFP-Nl-SPS-aFGF,对重组质粒做测序和酶切鉴定；3.体外实验分组、基因转染及检测表达情况：经鉴定正确的细胞随机分为3组：目的基因组(aFGF+N1)、空载质粒组(N1)、空白对照组(Blank),前两组分别加入质粒PEGFP-N1-SPS-aFGF与pEGFP-N1质粒,空白对照组不加入任何质粒,均在脂质体Lipofectamine2000TM Reagent介导下转染,转染后荧光显微镜统计发绿色荧光的细胞占各组细胞比例,计算转染效率；转染2天后更换为含有G418的生长培养基进行稳定筛选；转染72h后利用实时荧光定量PCR与Western blot检测aFGF基因在MSCs中表达情况。4.动物神经损伤模型制作及检测移植细胞疗效：40只成年纯系Wister大鼠在全麻(10%水合氯醛腹腔注射)下切断右侧腓总神经胫前肌分支(距神经入肌点约1.5cm),缝合神经外膜,然后将大鼠随机分为4组：A组：胫前肌植入(aFGF+N1)组细胞；B组：胫前肌植入(N1)组细胞；C组：胫前肌植入(Blank)组细胞；D组：植入等量生理盐水。A组为实验组,B组、C组、D组为对照组,术后观察4周,4周后肉眼观察肌肉的外观形态、测量肌肉湿重、氯化金染色观察运动终板形态、诱发电位肌电图仪进行神经低频重复电刺激检测运动终板传导功能,具体方法为刺激坐骨神经,记录胫前肌肌电波波幅,在脉冲电流刺激频率为3-5Hz的条件下连续刺激9次,观察有无衰减,以第5个肌电波波幅比第一个降低10%以上为阳性,统计各组第五次刺激肌电波波幅衰减率均数。[结果]1.分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为MSCs;2.构建携带有aFGF基因真核表达质粒测序结果与GenBank公布的序列一致,酶切鉴定条带与实际大小相符；荧光显微镜观察到细胞转染6h后即有绿色荧光发出,荧光强度和表达细胞总数在72h达到高峰,传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达；G418筛选细胞最佳浓度为(?)00μg/ml,筛选30天仍然观察到存活细胞；转染后72h,实时荧光定量PCR结果显示目的基因组表达量平均相对比值(aFGF+N1)组(1464.96)显著高于N1组(1.016)、Blank组(1.000),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示aFGF表达呈极强阳性,而N1组及Blank组aFGF表达极弱。3.肉眼观察到A组自身对照可见两侧胫前肌对称且无明显肌萎缩,肌张力正常；B组、C组表现相近：右侧胫前肌部分萎缩,肌张力下降；D组：右侧胫前肌明显萎缩,肌张力下降最明显。胫前肌湿重：A组胫前肌湿重为1.213±0.101g,B组胫前肌湿重为0.950±0.085g,C组胫前肌湿重0.932±0.070g,D组胫前肌湿重0.761±0.131g。A组明显高于三个对照组,统计学分析有显著性意义。神经低频重复电刺激检查：A组所有大鼠神经低频重复电刺激时没有出现大的肌电波波幅衰减反应,衰减率为6.01±1.50%,没有出现阳性情况；B组、C组大鼠低频电刺激时出现较大的肌电波波幅衰减反应,但不及D组,3组阳性率均为90%。A组衰减率低于对照组,统计学分析有显著性意义。终板染色检查：A组可见运动终板结构完整、形态正常：B组、C组表现相近：失神经支配的运动终板形态不规则,轴索终末分支减少而杂乱,终板呈细条状或点状；D组：未见轴突,运动终板数量明显减少,形态不规则。[结论]1.两步酶消化法结合差速贴壁法提取大鼠MSCs方法可行；2.真核表达载体构建正确,基因表达正常；3.aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩方法可行。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-20
前言  20-21
第一章 MSCs分离、纯化、培养及鉴定  21-28
  1 材料与方法  21-23
    1.1 实验动物  21
    1.2 主要试剂及配置  21
    1.3 主要仪器  21
    1.4 培养瓶包被  21
    1.5 MSCs的取材、分离及纯化  21-22
    1.6 MSCs传代培养  22
    1.7 分化培养基诱导分化  22
    1.8 骨骼肌MSCs的鉴定  22-23
  2 结果  23-25
    2.1 MSCs形态、生长特性及分化  23
    2.2 MSCs免疫细胞化学染色鉴定  23-25
  3 讨论  25-27
    3.1 MSCs概述  25-26
    3.2 MSCs与失神经肌支配后运动终板退变及肌萎缩机制  26-27
  4 总结  27-28
第二章 aFGF基因真核表达载体构建、转染MSCs及基因表达功能检测  28-44
  1 材料与方法  28-32
    1.1 实验材料  28-29
    1.2 实验方法  29-32
  2 结果  32-39
    2.1 aFGF基因获取  32
    2.2 质粒酶切和测序鉴定  32
    2.3 Lipofectamine~(TM)2000 Reagent转染及G418筛选浓度的选择  32-33
    2.4 转染效率测定  33
    2.5 目的基因表达检测  33-39
  3 讨论  39-43
    3.1 基因治疗概述  39
    3.2 目的基因选择  39-40
    3.3 靶细胞选择  40-41
    3.4 载体选择和目的基因导入靶细胞方法  41-42
    3.5 目的基因表达和调控  42-43
  4 总结  43-44
第三章动物损伤模型制作及移植携带aFGF基因的MSCs疗效评价  44-58
  1 材料与方法  44-46
    1.1 材料  44
    1.2 方法  44-46
  2 结果  46-55
    2.1 肉眼形态学检查结果  46
    2.2 胫前肌湿重检测结果  46-47
    2.3 光镜组织学检查结果  47-48
    2.4 神经肌肉接头低频重复电刺激检测结果  48-55
  3 讨论  55-57
    3.1 神经损伤概述  55-56
    3.2 神经损伤后运动终板退变及肌萎缩机制  56-57
    3.3 转基因MSCs对预防运动终板退变及萎缩效果评价  57
  4 总结  57-58
全文总结  58-59
参考文献  59-65
中英文缩略词  65-66
综述  66-77
  参考文献  73-77
攻读学位期间成果  77-78
致谢  78-80

aFGF基因转染MSCs预防运动终板退变及肌萎缩研究

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