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HSPA12B对内毒素刺激的小鼠肺微血管内皮细胞的作用及其机制

作　者: 余桂芳
导　师: 朱科明
学　校: 第二军医大学
专　业: 麻醉学
关键词: 热休克蛋白A12B 小鼠肺微血管内皮细胞 CLP模型 内毒素 急性肺损伤 HSPA12B mPMVEC 敲除 绿色荧光蛋白 肺微血管内皮细胞 LPS损伤 磷酸化p38 p38MAPK信号通路
分类号: R459.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景及总体思路脓毒症时，肺脏是最易受损伤的重要脏器之一，急性肺损伤（ALI）出现早，发生率高，一直是脓毒症研究的热点之一。内毒素（lipopolysaccharide，LPS）导致的肺微血管内皮细胞（pulmonary micro-vascular endothelial cells，PMVECs)损伤，可引起肺血屏障功能障碍。脓毒症时，内毒素导致的急性肺损伤，其发生发展中关键细胞之一是肺微血管内皮细胞。因此，保护脓毒症损伤的PMVECs具有重要的临床价值。在脓毒症相关性急性肺损伤研究中，不少学者重视细胞内源性保护机制，关注热点之一就是热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）。HSPs是细胞在应激状态下产生增多的一类保护性蛋白质。而其中热休克蛋白A12B（Heat shock proteinA12B,HSPA12B)是新近发现的一种热休克蛋白，是HSP70家族中的远亲，大量存在于动脉粥样硬化斑块中，与血管生成保护相关。研究表明，HSPA12B在斑马鱼生长过程中和离体细胞血管形成中占有重要的作用。但脓毒症时内毒素对肺组织的PMVECs中HSPA12B表达变化产生何种影响？HSPA12B表达变化对PMVECs具有何种作用？其产生作用的可能机制怎样？尚有待进一步研究。本研究通过在体的盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠模型和LPS刺激小鼠肺微血管内皮细胞的离体实验，检测脓毒症时HSPA12B在各时间点的表达水平；用小干扰RNAs（siRNAs）下调mPMVECs中HSPA12B的表达后，观察mPMVECs迁移和凋亡的变化，以及检测LPS刺激mPMVECs产生的炎症因子，研究HSPA12B对LPS处理的PMVECs的作用，并探讨其与MAPK信号通路中p38的关系。第一部分脓毒症时内毒素对鼠肺组织中HSPA12B表达的影响目的探讨HSPA12B在盲肠结扎穿孔(CLP)小鼠模型的肺组织中和LPS刺激的mPMVECs中的表达及其规律。方法1.构建鼠CLP模型，分别在0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h断头取肺。应用RT-PCR法检测肺组织中HSPA12B mRNA的水平，探讨脓毒症时肺组织中HSPA12B表达变化。2.培养mPMVECs，倒置显微镜下观察各时间点内皮细胞形态，用终浓度为1μg/ml的LPS刺激mPMVECs，分别于0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h收集细胞，应用RT-PCR法检测HSPA12B mRNA的水平，探讨LPS刺激的mPMVECs中HSPA12B表达变化。结果1. CLP模型3h、6h、9h、12h肺组织中HSPA12B表达逐步升高，12h达峰值，后又逐渐下降。2. LPS刺激mPMVECs，HSPA12B表达也呈现逐步升高，后又下降。结论脓毒症时内毒素对鼠肺组织和mPMVECs中HSPA12B表达具有一定影响，HSPA12B表达先升高后下降。第二部分用siRNA干扰法下调原代mPMVECs上HSPA12B的表达目的用siRNA干扰法下调原代mPMVECs上HSPA12B的表达并验证之。方法分别将siRNA和空白对照的siRNA通过脂质体Lippo2000TM转入mPMVECs内，实验分为两部分：1.通过转入带荧光的siRNA观察细胞的转染效率；2.用RT-PCR及Western Blot法检测HSPA12B的表达水平，验证siRNA的干扰效果。结果1.通过荧光显微镜观察到mPMVECs均有绿色荧光蛋白表达，说明siRNA转入到细胞内。2. RT-PCR和Western Blot检测到mPMVECs中HSPA12B表达下调。结论成功构建HSPA12B表达下调的mPMVECs。第三部分HSPA12B表达下调后LPS对mPMVECs的迁移功能、炎症反应以及凋亡的影响目的探讨HSPA12B对LPS刺激的mPMVECs迁移功能、炎症反应和凋亡情况的影响。方法根据以下情况将mPMVECs分为四组：①空白组、②LPS刺激组、③LPS+HSPA12B siRNA组、④LPS+空白siRNA组，分别置于37oC5%CO2潮湿孵箱内培养，用LPS与细胞共培养24h，取出细胞后用RT-PCR检测IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α mRNA表达情况,使用划痕实验和transwell小室检测细胞迁移情况，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化。结果RT-PCR检测结果表明：mPMVECs经LPS刺激24h后，与平行对照组（LPS+空白siRNA组）相比，HSPA12B表达下调组IL-6和TNF-α mRNA表达水平显著上升，而IL-10则表达下降，且均有统计学意义（P <0.05）。迁移实验表明：与平行对照组对比，HSPA12B表达下调组的mPMVECs的迁移功能明显减弱；凋亡实验表明：与平行对照组相比，HSPA12B表达下调组LPS刺激后mPMVECs凋亡明显增多；透射电子显微镜结果显示：与平行对照组相比，HSPA12B表达下调组细胞超微结构破坏加重。结论LPS刺激的HSPA12B表达下调的mPMVECs迁移功能减弱、炎症反应增强、凋亡明显。说明HSPA12B可能对内毒素刺激的小鼠肺微血管内皮细胞具有一定的保护作用。第四部分HSPA12B对LPS诱导的mPMVECs中MAPK信号通路中p38的作用目的研究HSPA12B对LPS诱导的mPMVECs中MAPK信号通路中p38的作用，初步探讨HSPA12B保护鼠肺微血管内皮细胞的可能机制。方法实验先分两组：转染空白siRNA组和转染HSPA12B siRNA组，观察LPS刺激24小时后，内皮细胞上磷酸化p38（p-p38）、总p38（total p38）和β-actin蛋白表达水平；用Western blot法检测p38表达变化情况。再将实验分成4组①LPS组、②LPS+siRNA组、③LPS+siRNA+p38MAPK抑制剂(SB203580)组和④LPS+siRNA+等剂量SB203580溶剂DMSO组，观察mPMVECs迁移功能、凋亡和炎症因子表达情况。最后LPS刺激mPMVECs24h后，用免疫荧光双标和免疫共沉淀方法观察HSPA12B和p38MAPK蛋白间的相互作用。结果Western blot分析法检测各组p-p38、total p38和β-actin，发现HSPA12B干扰组p-p38显著增强，p-p38和total p38灰度值之比明显增大，且有统计学意义（P <0.05）。SB203580可明显逆转HSPA12B表达下调所致的mPMVECs迁移功能抑制、凋亡增加和炎症因子基因表达改变。免疫荧光双标和免疫共沉淀实验证实HSPA12B与p38MAPK信号通路中p38蛋白相互作用。结论HSPA12B表达下调的mPMVECs中p38磷酸化显著增强，而LPS刺激的HSPA12B表达下调的mPMVECs迁移功能减弱、炎症反应增强、凋亡明显，且SB203580可逆转这些变化，免疫荧光双标和免疫共沉淀实验进一步说明HSPA12B可能通过降低p38磷酸化水平来抑制LPS对内皮细胞的损伤，从而对LPS诱导的内皮细胞发挥保护作用。

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学 > 急症、急救处理
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