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绿豆过敏原酶联免疫检测方法的研究

作　者: 谈超
导　师: 张燕
学　校: 天津科技大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 绿豆蛋白食品过敏原多克隆抗体间接竞争酶联免疫检测方法双抗体夹心酶联免疫检测方法
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目前国内外还没有对绿豆过敏原检测方法的报道,但其对敏感人群的致敏危害严重。因此建立一种简单、快速的绿豆过敏原酶联免疫检测方法具有重要的现实意义。本论文通过实验研究建立了绿豆过敏原的酶联免疫检测方法。首先从绿豆中提取绿豆蛋白,通过SDS-PAGE分析得到主要的绿豆蛋白分子量50,38,34和25kDa,用考马斯亮蓝G-250法对得到的蛋白定量。通过免疫BALB/c小鼠建立绿豆蛋白致敏模型,得到效价最高的一组为用弗氏佐剂,经皮下注射,并且第4次免疫14天后采全血组的抗血清,效价达1：64000。免疫新西兰大耳白兔,获得效价达1：32000的绿豆蛋白多克隆抗血清。采用免疫印迹法分析鼠抗绿豆蛋白抗血清和兔抗绿豆蛋白抗血清的亲和性,得到两种抗血清与蛋白在50和25kDa有强的结合。与九种蛋白的交叉反应结果显示,抗体的特异性较高。然后通过对免疫分析条件的优化,建立了灵敏的双抗体夹心酶联免疫检测方法。包被捕获抗体0.5μg/well,0.5%脱脂乳粉作为封闭液,从5u g/mL开始2倍梯度稀释绿豆蛋白,用PBS1：20000倍稀释检测抗体,HRP标记羊抗鼠二抗1：10000倍稀释,室温显色20min。此法具有较高的灵敏度,检测限为4.99ng/mL。准确度高,样品加标回收率为80.35%-88.41%。且稳定性好,板内变异1.58%-3.78%,板间变异3.14%-6.41%。进一步考察了热加工过程对食品过敏原结构稳定性的影响。在干热加工条件下,绿豆蛋白和绿豆粉的热加工相比较可以看出,随着温度的升高,蛋白的热加工造成的过敏原变化剧烈。在湿热加工条件下,绿豆蛋白的抗原稳定性变化不大,而蛋白溶液的抗原稳定性明显下降。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-16
  1.1 过敏原概述  8-11
    1.1.1 食品过敏原及产生原因  8
    1.1.2 食品过敏原研究现状  8-9
    1.1.3 食品过敏原检测方法  9-10
    1.1.4 食品过敏原研究前景  10-11
  1.2 免疫分析技术概述  11-13
    1.2.1 免疫分析基本理论  11-12
    1.2.2 免疫分析分类  12
    1.2.3 酶联免疫分析基本理论  12-13
  1.3 食品过敏原酶联免疫分析技术  13-14
  1.4 绿豆过敏原  14
  1.5 论文研究的目的及意义  14-15
  1.6 研究内容  15-16
2 材料与方法  16-29
  2.1 实验材料  16-19
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2 主要药品  16-17
    2.1.3 主要试剂  17
    2.1.4 仪器及材料  17
    2.1.5 待测样品  17-18
    2.1.6 常用溶液的配制  18-19
  2.2 实验方法  19-29
    2.2.1 绿豆蛋白的制备和鉴定  19-20
    2.2.2 BALB/c小鼠致敏模型的建立  20-22
    2.2.3 兔抗绿豆蛋白多克隆抗体的制备  22-23
    2.2.4 抗血清亲和性的测定  23-24
    2.2.5 双抗体夹心酶联免疫检测方法(Sandwich ELISA)的建立  24-25
    2.2.6 间接竞争酶联免疫检测方法(Indirect competition ELISA,icELISA)的建立  25-26
    2.2.7 两种免疫检测方法的对比  26
    2.2.8 抗体特异性的测定  26-27
    2.2.9 双抗体夹心酶联免疫检测方法性能指标评价  27
    2.2.10 热加工对过敏原稳定性的影响  27-29
3 结果与讨论  29-47
  3.1 绿豆蛋白的制备和鉴定  29-30
    3.1.1 SDS-PAGE分析所得绿豆蛋白  29
    3.1.2 绿豆蛋白的定量  29-30
  3.2 BALB/c小鼠致敏模型的建立  30-32
    3.2.1 BALB/c小鼠抗血清效价的测定  30-32
  3.3 兔抗绿豆蛋白多克隆抗体的制备  32-33
    3.3.1 兔抗血清效价的测定  32
    3.3.2 兔抗血清的纯化  32-33
    3.3.3 兔抗体浓度的确定  33
  3.4 抗血清亲和性的测定  33-34
  3.5 双抗体夹心酶联免疫检测法的建立  34-37
    3.5.1 捕获抗体包被量的选择  34
    3.5.2 封闭液种类的优化  34-35
    3.5.3 检测抗体稀释倍数的优化  35-36
    3.5.4 不同pH值和离子强度磷酸盐缓冲液的优化  36
    3.5.5 双抗体夹心酶联免疫检测方法标准曲线的绘制  36-37
  3.6 间接竞争酶联免疫检测法的建立  37-39
    3.6.1 最适工作浓度的优化  37-38
    3.6.2 间接竞争ELISA标准曲线的建立  38-39
  3.7 两种免疫检测方法的比较  39
  3.8 抗体的特异性  39-41
  3.9 双抗体夹心酶联免疫检测方法性能指标评价  41-43
    3.9.1 检测限与定量限  41
    3.9.2 准确度  41
    3.9.3 精密度  41-43
    3.9.4 稳定性  43
  3.10 热加工对过敏原稳定性的影响  43-47
    3.10.1 绿豆蛋白的干热加工  44
    3.10.2 绿豆粉的干热加工  44-45
    3.10.3 湿热加工  45-47
4 结论  47-48
5 展望  48-49
6 参考文献  49-54
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  54-55
8 致谢  55

绿豆过敏原酶联免疫检测方法的研究

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