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浦东机场口岸蝇类携带病原菌的鉴定及消毒剂耐药性的研究

作　者: 陈拓
导　师: 李飞；曹晓梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 口岸蝇类病原菌新菌种消毒剂抗性
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

口岸是物流、人流量较大的地区,不仅存在疾病传播的风险,还面临外来新物种入侵的可能。蝇类是口岸重要的医学昆虫,携带的病菌与脓肿创伤、外科感染、胃肠疾病、食物中毒等密切相关。所以口岸地区杀虫消毒、外来生物监测显得十分必要。此前对医院分离病原菌耐药性的研究较多,而对口岸分离病原菌的消毒剂抗性却鲜有报道。本论文结合生理生化反应测定和16SrRNA序列测定两种细菌鉴定方法,对2011年4月在上海浦东机场口岸捕获的蝇类体表、体内携带的病原茵进行了分离、鉴定。发现其中一株为之前国内未报道的条件致病菌Wohlfahrtiimonas chitiniclastica,测定了其生理生化反应,对其16S rRNA系统发育进行了.分析,并对其基因组序列进行了测序。另外,对分离的24株病原茵对消毒剂的抗性进行了测定,检测了携带的抗性基因。本研究结果对口岸蝇类及蝇媒细菌的监测提供了依据,并对口岸消毒剂的使用有指导意义。一、浦东机场口岸蝇类携带病原菌种类将浦东机场捕获的蝇类体表、体内细菌分离培养,单克隆菌株经Vitek2Compact微生物自动分析及16SrRNA基因序列比对。结果在7种蝇体表检出18种菌,其中致病菌2种,条件致病菌14种,包括1株国内未报道的条件致病菌株Wohlfahrtiimonas chitiniclastica;蝇体内检出14种菌,其中致病菌1种,条件致病菌12种；携带菌种类最多的是酱麻蝇,其次为亮绿蝇。二、Wohlfahrtiimonas chitiniclastica的分离、16S rRNA鉴定及分子系统发育从大头金蝇体表分离出一株细菌(实验编号为SH04),对其16SrRNA序列进行PCR扩增、测序,通过与NCBI数据库Blast比对,该菌与Wohlfahrtiimonas chitiniclastica典型菌株S5的16S rRNA相似度为98.86%,W. chitiniclastica曾在阿根廷引起流浪人员暴发性脓毒症。用API20NE和Vitek2两种方法测定了SH04菌株的生理生化反应,使用Mega5软件,Neighbour-joining方法,构建16SrRNA序列的系统发育树,生理生化反应和进化树分析结果表明,SH04菌株为上海浦东口岸大头金蝇体表分离到的W. chitiniclastica菌的新记录。之后,对W. chitiniclastica SH04菌株的基因组进行了测序。三、蝇媒细茵消毒剂抗性和抗性基因的检测从上海浦东机场捕获蝇类中分离的细菌中选取4种共24株病原菌,采用肉汤稀释法,测定了对三种口岸常用消毒剂的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),相对于标准菌株,分离菌株除了肺炎克雷伯菌,对84消毒液和戊二醛的MIC和MBC值升高均不明显,而对双链季铵盐出现了多株高MIC和MBC值的菌株。应用PCR技术检测了3个研究较多的消毒剂抗性基因qacA/B,smr和qacE△1-sul1的携带情况,在24株菌种检测到5株携带qacE△1-sul1片段,阳性率为20.83%。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词中英文对照  11-13
第一章文献综述  13-23
  一、口岸蝇类生物多样性及携带病原微生物  13-15
    1.1 口岸蝇种分布情况  13-14
    1.2 口岸蝇类输入性情况  14
    1.3 口岸蝇类体表体内携带致病菌情况  14-15
  二、细菌的种属鉴定  15-17
    2.1 细菌的数值分类和自动化鉴定  15-16
    2.2 细菌的16S rRNA基因测序  16-17
  三、细菌对消毒剂的抗性  17-20
    3.1 消毒剂抗性定义  18
    3.2 消毒剂抗性现状  18-19
    3.3 消毒剂抗性的机制  19-20
  四、研究目的及意义  20-23
第二章浦东机场口岸蝇类携带病原菌种类及16S rRNA鉴定  23-33
  摘要  23
  1. 材料与方法  23-25
    1.1 实验样本  23
    1.2 主要试剂和仪器  23-24
      1.2.1 主要试剂  24
      1.2.2 主要仪器设备  24
    1.3 实验方法  24-25
      1.3.1 蝇体表细菌培养  24
      1.3.2 蝇体内细菌培养  24-25
      1.3.3 细菌分离纯化  25
      1.3.4 细菌的生化鉴定  25
      1.3.5 16S rRNA鉴定  25
  2 结果  25-30
    2.1 Vitek2 Compact微生物自动分析仪鉴定及16S rRNA比对结果  25-28
    2.2 不同蝇种体表携带细菌种类  28-30
    2.3 不同蝇种体内携带细菌种类  30
  3 讨论  30-33
第三章 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica的分离和16S rRNA鉴定及分子系统发育  33-43
  摘要  33-34
  1 材料与方法  34-37
    1.1 实验样本  34
    1.2 主要试剂和仪器  34
      1.2.1 主要试剂  34
      1.2.2 主要仪器设备  34
    1.3 实验方法  34-37
      1.3.1 蝇体表细菌培养  34
      1.3.2 蝇体内细菌培养  34
      1.3.3 细菌分离纯化  34
      1.3.4 细菌的生化鉴定  34-36
      1.3.5 基因组提取  36-37
      1.3.6 W.chitiniclastica的基因组测序  37
      1.3.7 16S rRNA鉴定及系统进化分析  37
  2 结果  37-41
    2.1 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica的生化鉴定  37-39
    2.2 W.chitiniclastica的16S rRNA序列的Blast比对结果  39-40
    2.3 W.chitiniclastica的16S rRNA序列的系统发育分析  40-41
    2.4 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica的基因组测序  41
  3 讨论  41-43
第四章蝇媒细菌消毒剂抗性和抗性基因的检测  43-49
  摘要  43
  1 材料和方法  43-45
    1.1 实验样本  43-44
    1.2 主要仪器和试剂  44
      1.2.1 主要试剂  44
      1.2.2 主要仪器设备  44
    1.3 实验方法  44-45
      1.3.1 中和剂筛选  44
      1.3.2 试验菌悬液的制备  44
      1.3.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定  44-45
      1.3.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定  45
      1.3.5 消毒剂抗性基因检测  45
  2 结果  45-47
    2.1 MIC,MBC测定结果  45-47
    2.2 消毒剂抗性基因检测结果  47
  3 讨论  47-49
全文总结  49-51
参考文献  51-57
附录  57-59
致谢  59

浦东机场口岸蝇类携带病原菌的鉴定及消毒剂耐药性的研究

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