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分枝杆菌系统进化及其硝基还原酶基因克隆表达

作　者: 丁朋举
导　师: 惠明
学　校: 河南工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 分枝杆菌系统发育硝基还原酶基因克隆表达响应面优化
分类号: R378.911
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌是引起人类患结核病的主要病原微生物,目前结核病仍然是我国严重的公共卫生问题。本文旨在通过对结核分枝杆菌(北京谱系)的群体遗传关系及脓肿分枝杆菌中硝基还原酶基因的克隆表达相关研究,希望能够为结核病防控策略的制定及快速准确的鉴定分枝杆菌提供参考依据。本文首先采用24位点VNTR基因分型技术对我国北方五省(黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和宁夏)的234株结核分枝杆菌(北京谱系)进行了分型鉴定,各VNTR位点的等位基因多态性(h)普遍较低(h值范围：0.000-0.744)；个体水平系统发育分析显示各菌株分散存在于N-J树的各个进化分枝,最小生成树中约62.0%(145/234)的菌株被划分到同一“克隆复合群”;群体水平系统发育树显示234株菌与MIRU-VNTRplus数据库(http://www.miru-vntrplus.org)中的结核分枝杆菌(北京谱系)的遗传关系最近(Bootstrap值为100)；通过贝叶斯模型计算了最近共祖年代约为5308年(95%CIs：4263年-6470年)；分子方差分析结果表明吉林与黑龙江、辽宁两省菌株之间,内蒙古与宁夏菌株之间遗传分化系数不存在显著统计学差异(P>0.05)。采用生物信息学方法对脓肿分枝杆菌中被注释为" putative nitroreductase "的基因进行了预测分析,结果显示该基因编码219个氨基酸；对应的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质(不稳定系数为54.52,总平均亲水性为-0.244)；理论分子量和等电点分别为24.38KDa和6.52；蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主要构件；氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%,空间结构预测表明该蛋白是硝基还原酶家族成员之一,可能具有还原对硝基苯甲酸的功能。利用大肠杆菌表达系统对"putative nitroreductase"基因进行了体外表达,目的蛋白以包涵体形式存在；采用亲和层析方法对包涵体蛋白进行了纯化,并通过透析复性处理,得到了可溶性的目的蛋白；灰度扫描分析结果显示其纯度为89.6%; Western blot结果显示在约30KDa处得到了显色带,且特异性较好；BCA蛋白定量法测得其浓度为0.59μg/μL;酶的比活力为32.2U/mg。应用Plackett-Burman设计考察了影响目的蛋白表达量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、IPTG、诱导温度、诱导时间、卡那霉素浓度和pH值8个因素,从中筛选出了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间三个主要影响因素；通过最陡爬坡实验逼近最大响应区域并找出了响应面优化的中心点；运用Box-Behnken设计及响应面分析法确定了重要因素的最佳水平,即IPTG浓度：0.67mM、诱导温度：40℃、诱导时间：6.8h,Y的最大估计值为59.4%。对模型预测的准确性进行了验证,实验结果接近优化预测值。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-20
  1.1 分枝杆菌的生物学特性  11
  1.2 分枝杆菌的系统进化分析  11-14
    1.2.1 分枝杆菌的系统进化  11-12
    1.2.2 分枝杆菌基因分型的技术方法  12-14
  1.3 分枝杆菌中硝基还原酶基因的克隆表达  14-18
    1.3.1 分枝杆菌中的硝基还原酶基因  14-16
    1.3.2 分枝杆菌中硝基还原酶的获取  16-18
  1.4 本研究的目的及意义  18-20
第二章中国北方五省结核分枝杆菌的群体遗传关系  20-32
  2.1 实验材料  20-22
    2.1.1 菌株  20-21
    2.1.2 主要试剂  21-22
    2.1.3 仪器设备  22
    2.1.4 主要溶液及配制  22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 基因分型  22-23
    2.2.2 数据分析  23
  2.3 实验结果  23-29
    2.3.1 24个VNTR位点的等位基因多态性  23-26
    2.3.2 个体水平系统发育分析  26-27
    2.3.3 北京谱系MTB最近共祖年代计算  27-29
    2.3.4 五省北京谱系MTB的分子方差分析  29
  2.4 讨论  29-32
第三章硝基还原酶的生物信息学分析  32-38
  3.1 实验材料  32
  3.2 实验方法  32-33
  3.3 实验结果  33-36
    3.3.1 硝基还原酶基因所编码氨基酸的理化性质  33
    3.3.2 蛋白质的一级结构分析  33-34
    3.3.3 Nrd蛋白的二级结构分析  34
    3.3.4 Nrd蛋白的功能结构分析  34-35
    3.3.5 Nrd蛋白的三级结构预测  35-36
  3.4 讨论  36-38
第四章硝基还原酶基因的克隆、表达及纯化  38-55
  4.1 实验材料  38-43
    4.1.1 菌种和质粒  38
    4.1.2 主要试剂  38-40
    4.1.3 仪器设备  40
    4.1.4 主要溶液及配制  40-43
  4.2 实验方法  43-50
    4.2.1 基因组DNA的提取  43
    4.2.2 引物设计与PCR扩增  43-44
    4.2.3 克隆载体的构建  44
    4.2.4 TA克隆  44-45
    4.2.5 重组质粒的提取及双酶切鉴定  45-46
    4.2.6 表达质粒的构建  46-47
    4.2.7 硝基还原酶的诱导表达  47
    4.2.8 目的蛋白的表达情况  47-48
    4.2.9 包涵体蛋白的纯化  48-49
    4.2.10 柱再生  49
    4.2.11 重组蛋白的鉴定  49-50
  4.3 结果与分析  50-53
    4.3.1 PCR扩增  50-51
    4.3.2 pGMT-Nrd重组质粒鉴定  51-52
    4.3.3 重组蛋白的原核表达  52-53
    4.3.4 目的蛋白的Western Blot鉴定  53
  4.4 讨论  53-55
第五章硝基还原酶的透析复性及活性分析  55-63
  5.1 实验材料  55-56
    5.1.1 主要试剂  55
    5.1.2 仪器设备  55
    5.1.3 主要溶液及配制  55-56
  5.2 实验方法  56-59
    5.2.1 透析袋的处理  56-57
    5.2.2 包涵体蛋白溶液透析  57
    5.2.3 透析复性后蛋白溶液的浓缩  57
    5.2.4 SDS-PAGE检测复性后目的蛋白纯度  57
    5.2.5 浓缩后蛋白质含量的测定  57-58
    5.2.6 酶活性的测定  58-59
  5.3 实验结果  59-61
    5.3.1 复性后目的蛋白的SDS-PAGE电泳检测  59-60
    5.3.2 蛋白质浓度的测定  60
    5.3.3 硝基还原酶活性的测定  60-61
  5.4 讨论  61-63
第六章硝基还原酶表达条件的优化  63-74
  6.1 实验材料  63-64
    6.1.1 实验菌株  63-64
    6.1.2 主要试剂  64
    6.1.3 仪器设备  64
    6.1.4 主要溶液及配制  64
  6.2 实验方法  64-66
    6.2.1 Plackett-Burman设计筛选影响目的蛋白表达量的重要因素  64-65
    6.2.2 最陡爬坡实验设计  65
    6.2.3 Box-Behnken设计  65-66
    6.2.4 实验验证  66
  6.3 结果与分析  66-72
    6.3.1 Plackett-Burman设计显著因素的筛选  66-67
    6.3.2 最陡爬坡实验  67-68
    6.3.3 显著因素最佳水平的确定  68-70
    6.3.4 响应面图直观分析  70-72
    6.3.5 实验验证  72
  6.4 讨论  72-74
第七章结论  74-76
  7.1 全文总结  74-75
  7.2 后续展望  75-76
参考文献  76-82
致谢  82-83
个人简介  83

分枝杆菌系统进化及其硝基还原酶基因克隆表达

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