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阿托伐他汀对Aβ_1-42引起体外培养海马神经元损伤的保护作用

作　者: 屈文慧
导　师: 金英
学　校: 辽宁医学院
专　业: 药理学
关键词: 阿托伐他汀海马神经元淀粉样β蛋白突触素突触后致密蛋白95 凋亡
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的探讨阿托伐他汀对Aβ1-42引起体外培养海马神经元损伤是否保护作用。方法选用出生0~24h的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，在无菌条件下取出乳鼠大脑再分离出海马，剪碎后用0.125%胰蛋白酶消化10min，DMEM/F12培养基培养，培养7d的神经元用于实验。实验分为三部分，第一部分观察正常体外培养的海马神经元突起自然生长状况。正常细胞培养，不加入任何药物每3d半量换液一次，应用倒置相差显微镜观察并记录3d，7d和14d神经元突起的生长状况。第二部分探讨Aβ1-42引起体外培养海马神经元损伤作用。实验分组：分为正常对照组；Aβ1-42不同浓度(10、25、50、100nmol·L-1)处理组和Aβ1-42作用不同时间(24h、48h、96h)组。第三部分探讨Ato对Aβ1-42引起体外培养海马神经元损伤的保护作用。实验分组：正常对照组海马神经元加入0.1%DMSO作用48h；Aβ1-42处理组加入聚集状态的Aβ1-4250nmol L-1作用48h；Aβ1-42+Ato组海马神经元先加入Ato5μmol L-1作用1h，然后加入聚集状态的Aβ1-4250nmol L-1作用48h；单独Ato5μmol L-1处理组海马神经元加入Ato5mol L-1作用48h。应用微管相关蛋白-2(MAP2)免疫荧光染色后测量树突分支总长度(Total dendriticbranch length, TDBL)和一级树突数目(Primary-order dendrite number, PDN)，观察神经元树突生长情况。β-Tubulin免疫荧光染色观察神经元轴突的生长情况。应用免疫荧光染色和Western印迹法检测海马神经元突触素(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD95)蛋白的表达水平改变。应用Hoechst33258核染色检测神经元凋亡；Western印迹法检测活性胱天蛋白酶3(Caspase3)蛋白表达水平。结果应用倒置相差显微镜观察结果发现，培养3-4d的海马神经元，可呈现出典型神经元形状，即以双极和多极神经元为主，大多为梭形或锥体形，表面光滑，折光性强，可见部分神经元突起生长明显。培养6-7d的海马神经元，突起长度明显增粗增长，胞体大而透亮，光晕明显，由于此时细胞之间刚好生长联成稀疏网络，所以用于计数、测量神经元树突和研究抑制神经元突起生长干扰因素均为可行。培养8-10d海马神经元，神经细胞胞体开始聚集且继续增大，光晕明显，细胞团之间突起增长连接成密集神经网络。随培养时间延长，神经元突起纵横交错，较难以辨认突起起源。14-15d后海马神经元生长状态良好，胞体和突起清晰可持续，胞体不再增大，聚集更加明显，突起继续增粗增长。给予不同浓度Aβ1-42(10、25、50、100nmol·L-1)作用48h，倒置相差显微镜和免疫荧光染色结果显示，自Aβ1-4225nmol·L-1起海马神经元突起均出现明显退行性改变特征，表现为轴突静脉曲张样改变、树突总长度和一级树突数明显减少，并呈明显浓度依赖性，以Aβ1-4250nmol·L-1和Aβ1-42100nmol·L-1作用较为显著，Aβ1-4210nmol·L-1作用不是很明显。因此在之后的实验中Aβ1-42的终浓度均选用作用明显且对细胞没有过度损伤的Aβ1-4250nmol·L-1。根据不同浓度Aβ1-42处理组对突起的影响，我们选用Aβ1-4250nmol·L-1加入培养7d神经元分别作用24h、48h、96h，结果显示，Aβ1-4250nmol·L-1作用24h，就可使培养神经元TDBL和PDN均有减少，作用48h后TDBL、PDN进一步减少且更明显。在加入Aβ1-4250nmol·L-1前1h，先加入Ato5μmol L-1可明显对抗Aβ1-42引起的神经元的退行性改变，表现为TDBL和PDN较Aβ1-42组明显延长，突起静脉曲张样改变和突起回缩较Aβ1-42组明显减轻。Western结果进一步证明，加入不同浓度Aβ1-42(10、25、50、100nmol·L-1)作用48h除Aβ1-4210nmol·L-1以外均可减少SYP、PSD95蛋白表达水平，Aβ1-4250nmol·L-1和Aβ1-42100nmol·L-1作用最为明显；同时不同时间Aβ1-42(24h、48h、96h)也可减少SYP、PSD95蛋白表达水平，作用48h较为明显。在加入Aβ1-4250nmol·L-1前1h，加入Ato5μmol L-1可明显对抗Aβ1-42引起的SYP、PSD95蛋白表达的减少。结论1、Aβ1-42对体外培养的海马神经元突起发育具有损伤作用。2、阿托伐他汀能够对抗Aβ1-42引起的体外培养海马神经元的损伤，这种损伤作用可能与激活胱天蛋白酶3有关。

全文目录

摘要  4-7
abstract  7-10
英文缩略语  10-11
前言  11-13
实验材料与方法  13-17
结果  17-31
讨论  31-35
结论  35-36
本研究创新性的自我评价  36-37
参考文献  37-41
附录  41-52
  一、文献综述  41-49
    参考文献  46-49
  二、科研成绩  49-50
  三、致谢  50-51
  四、个人简介  51-52

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