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HCN4在微波辐射致大鼠窦房结损伤中的作用研究

作　者: 刘燕青
导　师: 彭瑞云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 大鼠 SAN 微波 HCN4 β1-AR和M2-AchR
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的和意义：随着微波技术的飞速发展和信息时代的来临，人们在享受便捷生活的同时，也面临着微波污染的危害。此外，微波技术在军事上的应用发展迅速，它不仅能严重破坏敌方电子设备，同时也能造成机体损伤。心脏传导系统是微波辐射敏感的靶标之一，SAN是心脏传导系统最重要的组成部分。然微波辐射致SAN损伤规律及量效关系未明，其致伤机制尚未见报道。HCN4可调控P细胞的起搏电流及维持其电生理功能。SAN组织中HCN4的异常表达可能是各种SAN病变发生的分子基础之一，而HCN4及其调控可能在微波辐射致大鼠SAN损伤中发挥重要作用。因此，研究微波辐射致SAN损伤中HCN4的改变、调控及其意义，将为深入研究微波辐射致心脏损伤的分子机制和防治措施提供新靶标和思路，为寻找敏感诊断指标和制定防护标准提供实验依据。材料和方法：（1）大鼠SAN定位及组织结构观察：采用二级Wistar成年大鼠20只，对右心房及与之相连的近段上腔静脉做水平连续切片，对切片行HE、Masson染色，光镜下观察连续切片，定位SAN并观察组织结构。（2）大鼠SAN超微结构观察：采用二级雄性Wistar成年大鼠10只，依据SAN位置、组织结构特点分两步取材，经树脂定向包埋，半薄切片甲苯胺蓝预染，光镜下定位后，再行超薄切片，透射电镜观察SAN超微结构。（3）微波辐射对大鼠SAN功能和结构的影响研究：采用平均功率密度为0、5、10、50mW/cm²的脉冲微波辐射160只二级雄性Wistar大鼠，辐射时间为6min，于辐射前、辐射后即刻、7d、14d、28d、3m、6m和9m，采用多道生理记录仪检测大鼠ECG的变化；于辐射后1d、7d、14d、28d、3m、6m、9m、12m，采用光镜和电镜观察大鼠SAN组织结构和超微结构变化；采用Masson染色、天狼猩红染色和图像分析技术，观察SAN组织胶原纤维含量的动态变化规律。（4）微波辐射后大鼠SAN组织HCN4改变及其调控机制研究：采用ISH、IHC和图像分析等方法，检测50mW/m2微波辐射后大鼠SAN组织中HCN4及其上游分子β1-AR、M2-AchR基因和/或蛋白的表达变化。（5）微波辐射对原代培养乳鼠SAN细胞的损伤效应及机制研究：以体外原代培养的SAN细胞为研究对象，采用倒置显微镜、AFM、LSCM、IF等技术，观察微波辐射对细胞形态结构、搏动特征、细胞膜结构、细胞内[Ca²⁺]及HCN4表达的影响。结果：（1）正常成年大鼠SAN位置和组织学特点：正常成年大鼠SAN位于上腔静脉与右心耳交界区及其以上的上腔静脉壁内，呈马蹄形/C形；大鼠SAN组织结构疏松，主要含有P细胞、T细胞和少量心房肌细胞，间质胶原纤维含量丰富。（2）正常成年大鼠SAN超微结构观察：甲苯胺蓝预染半薄切片的方法简便迅速，着色效果好，可有效缩短定位时间。电镜观察显示，大鼠SAN内主要含有两种细胞。①P细胞：胞体小，胞浆丰富，细胞器含量少；肌原纤维含量少，杂乱分布于细胞膜附近，几乎不含肌节；②T细胞：胞体较P细胞大，细胞器含量较多，肌原纤维可见明显肌节，常沿细胞纵轴排列，分布于细胞膜附近。（3）微波辐射对大鼠SAN功能的影响：5mW/cm²组未见明显异常；10和50mW/cm²微波辐射后大鼠SAN功能受损，主要表现为：心率呈先加快后减慢趋势；P波振幅降低；ECG出现窦性心律不齐、SAN内游走性心律和房性心律失常等。（4）微波辐射后大鼠SAN组织结构变化：5mW/cm²组未见明显异常；10和50mW/cm²微波辐射后1d，表现为P、T细胞水肿；T细胞排列呈波浪状改变；14～28d损伤最重，表现为细胞排列紊乱，部分细胞胞浆嗜酸性染色增强，核固缩深染；3m～6m损伤减轻呈恢复趋势，仍有部分细胞呈水肿状态；9m～12m表现为实质细胞减少，间质胶原纤维增多及脂肪浸润。以上改变尤以50mW/cm²组最为显著。（5）微波辐射后大鼠SAN超微结构变化：5mW/cm²组未见明显异常；10和50mW/cm²微波辐射后1d～28d表现为P、T细胞线粒体最早受累，出现肿胀，嵴断裂，甚至空化；肌原纤维局灶性溶解、断裂；可见P、T细胞核染色质浓缩、边集；细胞膜小凹减少或消失；血管周围间隙增宽、水肿；6m～12m表现为实质细胞退行性变，间质胶原原纤维增多、脂肪浸润。以上改变尤以50mW/cm²组最为显著。（6）微波辐射致大鼠SAN损伤后HCN4、β1-AR、M2-AchR变化：50mW/cm²微波辐射后1d～28d，大鼠SAN组织中HCN4mRNA表达上调（P<0.05或P<0.01），3m表达下调（P<0.05）；HCN4蛋白于辐射后1d～28d表达增加（P<0.05或P<0.01），3m～6m表达降低（P<0.05）；β1-AR mRNA于辐射后1d～3m表达上调（P<0.05或P<0.01）；β1-AR蛋白于辐射后1d～3m表达增加（P<0.05或P<0.01）；M2-AchR蛋白于辐射后1d～6m表达增加（P<0.05或P<0.01）。（7）微波辐射后体外培养SAN细胞形态结构、搏动特征变化：正常SAN细胞呈长梭形，伸出伪足或突起与周围细胞连接成片，呈单个细胞搏动，搏动速度快，节律规则。10和50mW/cm²微波辐射后，SAN细胞搏动明显减慢且节律不规则，细胞肿胀变圆，伪足和突起减少。50mW/cm²微波辐射后即刻SAN细胞内[Ca²⁺]升高（P<0.05），细胞膜表面可见穿孔现象。（8）微波辐射致体外培养SAN细胞损伤后HCN4表达改变：50mW/cm²微波辐射后即刻，SAN细胞中HCN4蛋白表达显著减弱（P＜0.01），12h表达显著增强（P＜0.05）。结论：（1）成年大鼠SAN特殊的位置提示：大鼠SAN取材时一定要保留上腔静脉近心段；两步法前固定取材有助于大鼠SAN电镜标本的制作。（2）10、50mW/cm²微波辐射导致大鼠SAN功能障碍、组织结构和超微结构损伤，上述改变与微波辐射剂量呈正相关。（3）10、50mW/cm²微波辐射可导致培养的SAN细胞形态结构损伤和搏动下降，且与微波辐射剂量呈正相关。（4）HCN4异常表达可能是微波辐射致SAN损伤的重要致伤分子之一。（5）SAN组织β1-AR高表达可能通过促进HCN4表达加重微波辐射后SAN组织损伤过程；M2-AchR高表达可能通过抑制HCN4表达促进微波辐射致SAN损伤后的修复过程。（6）细胞膜穿孔、细胞内钙超载、HCN4的高表达是微波辐射致SAN损伤的重要机制。

全文目录

缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-17
第一部分正常成年大鼠 SAN 的解剖学定位和形态学观察  17-32
  第一节正常成年大鼠 SAN 的解剖学定位和组织结构观察  17-26
    材料与方法  17-19
    结果  19-23
    讨论  23-25
    结论  25-26
  第二节正常成年大鼠 SAN 的超微结构观察  26-32
    实验动物  26
    实验设备与试剂  26-27
    观测指标与方法  27-28
    结果  28-29
    讨论  29-31
    结论  31-32
第二部分微波辐射对大鼠 SAN 功能和结构的影响研究  32-57
  第一节微波辐射对大鼠 SAN 功能的影响  32-41
    材料与方法  32-34
    结果  34-37
    讨论  37-40
    结论  40-41
  第二节微波辐射后大鼠 SAN 形态结构的损伤特点及量效关系  41-57
    材料与方法  41-43
    结果  43-52
    讨论  52-56
    结论  56-57
第三部分微波辐射后大鼠 SAN 组织 HCN4 改变及其调控机制研究  57-73
  材料与方法  57-62
  结果  62-67
  讨论  67-72
  结论  72-73
第四部分微波辐射对原代培养乳鼠 SAN 细胞的损伤效应及机制研究  73-90
  材料与方法  73-78
  结果  78-83
  讨论  83-89
  结论  89-90
参考文献  90-96
全文结论  96-97
综述  97-106
  参考文献  103-106
个人简历  106-107
攻读博士学位期间发表论文、承担课题、申请专利和获得奖励一览表  107-109
致谢  109-110

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